天根miRcute多糖多酚植物miRNA提取分离试剂盒 DP504

产品简介

操作步骤：

 使用前在漂洗液RWA和去蛋白液MRD中加入C₂H₆O，加入量请参见瓶上标 签。 

一、miRNA富集部分的提取 对miRNA的纯度要求较高时，比如miRNA芯片研究、miRNA克隆建议采用此方法。 

1．匀浆处理 50 mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，转入到1.5 ml离心管中，加入500 μl裂解液SLM，颠倒混匀以保证裂解液浸没所 有样本，再加入1/10裂解液体积的助沉剂PLA，立即涡旋震荡混匀。

 注意 1：对于预期RNA得率小于10 μg的植物样本，请使用100 mg的起始样本量；对于富 含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SLM用量增加至700 μl。 

注意 2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织RNA含 量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的样本量。 

2．室温，12,000 rpm(~13,400×g) 离心5 min。

 3．将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，室温12,000 rpm(~13,400×g) 离 心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收 集管中的细胞碎片沉淀。 

4. 量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的C₂H₆O， 混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 miRspin中，室温 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec。若一次不能全部加入到吸附柱 miRspin中，请分两次转入，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。

 5. 量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的C₂H₆O，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4 中，室温 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，若一次不能全部加入到吸附柱CR4中， 请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱CR4。

6. 向吸附柱CR4中加入700 μl去蛋白液MRD，室温静置2 min，室温 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液。

 7. 向吸附柱CR4中加入500 μl漂洗液RWA（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min， 室温 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液。

 8. 重复操作步骤7。 

9. 将吸附柱CR4放入2 ml收集管中，室温 12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，去除残余液 体。

 注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR4在室温放置2 min，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续 的RT等实验操作。

10. 将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free 1.5 ml离心管中，加50 μl RNase-Free ddH2O， 室温放置2 min，室温 12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。

 注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃， 以防降解。

注意：如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次。

二、 Total RNA的提取 提取的total RNA中含有miRNA等small RNA。

对miRNA的纯度要求不高时，比如在研 究miRNA RT-PCR、miRNA Northern blot时也可以采用此方法。

1. 匀浆处理 50 mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，转入到1.5 ml离心管中，加入500 μl裂解液SLM ，颠倒混匀以保证裂解液浸没所有 样本，再加入1/10裂解液体积的助沉剂PLA ，立即涡旋震荡混匀。

 注意1：对于预期RNA得率小于10 μg的植物样本，请使用100 mg的起始样本量；对于富 含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SLM用量增加至700 μl。

 注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA 含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的样本量。

 2. 室温，12,000 rpm(~13,400×g) 离心5 min。

 3. 将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g) 离心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集 管中的细胞碎片沉淀。

 4．缓慢加入1.5倍上清体积的C₂H₆O，混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和 沉淀一起转入吸附柱CR4中， 12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱CR4放回收集管中。

若一次不能全部转入吸附柱CR4 ，请分两步进行。 注意：如果上清液体积有损失，请相应调整无水乙醇的加量。 

5．向吸附柱CR4中加入700 μl去蛋白液MRD(使用前请检查是否已加入乙醇)，12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。