作为每天要帮实验室客户解决各种 Transwell 问题的实验耗材供应商，我见过太多同学因为操作细节没把控好，明明细胞状态没问题，最后却得不到能用的数据 —— 要么膜上细胞太少，要么下室细胞污染，甚至连 Transwell 小室怎么放都能搞错。

其实细胞迁移实验本身不复杂，但90% 的失败都藏在 “不起眼” 的细节里。今天就从 “耗材准备 - 细胞处理 - 实验操作 - 结果统计” 全流程，把我总结的实操要点和避坑经验分享给大家，新手照着做，基本能一次出有效数据。

一、实验前：耗材和试剂准备，这些 “预处理” 别省

很多人拿到 Transwell 小室就直接用，其实第一步 “预处理” 没做好，后续再努力也白费。先明确：我们常用的 Transwell 小室（迁移实验用无基质胶的，侵袭实验才加 Matrigel），核心是聚碳酸酯膜（孔径一般选 8μm，除非细胞特别大 / 小，比如神经元可能用 12μm），实验耗材膜的处理和试剂配比是关键。

1. Transwell 小室的预处理：别让 “气泡” 毁了实验

• 第一步：激活膜的亲水性

新的小室膜是疏水的，细胞没法附着迁移，必须先用水或培养基浸润激活。操作时用无菌枪头吸取无血清培养基（或 PBS），缓慢加到小室内部（膜上方），注意别戳到膜！加完后放在培养板孔里，室温静置 20-30 分钟，让膜充分吸水变亲水。

✅ 避坑：别用血清培养基激活！血清里的蛋白会提前吸附在膜上，反而影响细胞迁移。

• 第二步：去除膜上残留液体

激活后，用无菌吸头轻轻吸掉小室内部的培养基（动作要轻，别把膜吸破），再把小室倒扣在无菌滤纸上吸 10 秒，把膜上多余的液体吸干 —— 残留液体太多，会导致上室细胞悬液被稀释，影响细胞密度。

2. 试剂配比：血清浓度是 “迁移动力”，别乱加

Transwell 迁移的原理是 “趋化作用”：下室的血清（营养）吸引上室的细胞穿过膜，所以上下室的血清浓度差是关键，配比错了细胞根本不迁移。

• 上室：无血清培养基（或含 0.1%-0.5% 血清，避免细胞饥饿过度，但浓度绝对不能高于下室）

• 下室：含 10%-20% 血清的培养基（根据细胞类型调整，比如肿瘤细胞用 10% 足够，成纤维细胞可能需要 20%）

⚠️ 重点：下室加培养基时，要先加到培养板孔里，再放入预处理好的小室，避免小室下方产生气泡 —— 气泡会顶住膜，细胞穿不过去，最后下室没细胞，白做！

二、细胞处理：状态比数量更重要，这 3 步别错

很多同学纠结 “上室加多少细胞”，其实比数量更重要的是细胞状态—— passages 太多、有污染、贴壁不牢的细胞，迁移能力会差很多，数据根本不可信。

1. 细胞消化：别消化过度，避免损伤细胞膜

• 用胰酶消化时，看到细胞边缘收缩、轻轻吹打能散开就停，立刻加含血清的培养基终止消化（血清能中和胰酶）

• 别用枪头猛吹，避免细胞破裂 —— 破裂的细胞会沉在膜上，最后计数时会算成 “迁移细胞”，导致数据偏高。

2. 细胞计数：调整浓度，保证膜上细胞均匀

• 消化后的细胞离心（1000rpm，5 分钟），弃上清，用无血清培养基重悬（和上室培养基一致），吹成单细胞悬液

• 计数后调整浓度：一般上室加 2-5×10⁴个细胞 / 孔（24 孔板），具体看细胞大小 —— 比如 A549 细胞小，加 5×10⁴；HCT116 细胞大，加 2×10⁴。

✅ 技巧：如果不确定浓度，先做预实验（比如设 2、4、6×10⁴三个梯度），选 “24 小时后膜上还有少量未迁移细胞，下室有明显迁移细胞” 的浓度。

3. 上室加样：别让细胞堆积在中间

• 加细胞悬液时，枪头贴着小室内壁缓慢加（别直接滴在膜上），加完后轻轻晃一下小室，让细胞均匀分布在膜上

• 上室液体体积：24 孔板的小室，一般加 200μL（别加满，留一点空间，避免液体溢出到下室）

• 加完后把培养板放进孵箱，前 30 分钟别碰—— 让细胞先贴在膜上，避免移动导致细胞聚堆。

三、孵育和染色：时间别乱定，染色步骤要 “轻”

孵育时间和染色方法，直接影响最后能不能清晰计数，新手常在这里踩坑。

1. 孵育时间：根据细胞类型定，别盲目跟文献

• 大多数肿瘤细胞（如乳腺癌、肺癌细胞）孵育 24 小时足够；成纤维细胞迁移快，12-16 小时就够；内皮细胞慢，可能需要 36 小时

• 怎么判断时间到了？可以在孵箱里观察：用显微镜看小室膜下方，有明显细胞附着就可以终止，别孵育太久 —— 否则下室细胞太多，会重叠在一起，没法计数。

2. 固定和染色：别把膜弄破，别漏染

• 第一步：弃液

取出小室，先倒掉上室的培养基，再用 PBS 轻轻洗 2 次（别用劲冲，避免把膜上的细胞冲掉）

• 第二步：固定

用 4% 多聚甲醛（PFA）加满上室，室温固定 20 分钟（固定是为了让细胞贴在膜上，后续染色不会掉）

• 第三步：染色

弃掉 PFA，用 PBS 洗 2 次，然后加 0.1% 结晶紫染液（过滤后用，避免有杂质），室温染 15-20 分钟 —— 结晶紫是细胞核染色，颜色深，计数清晰。

✅ 避坑：染色后一定要用 PBS 轻轻洗去多余染液，直到洗出的水变清 —— 否则背景颜色太深，细胞和膜分不清。

3. 擦去上室未迁移细胞：这步是 “数据准确” 的关键

• 染色后，用无菌棉签（或细胞刮子）轻轻擦去小室上表面的细胞（这些是没迁移过去的），擦的时候要顺着一个方向，别来回蹭 —— 避免把膜擦破，或者把下表面的迁移细胞擦掉。

• 擦完后可以在显微镜下看一眼：上表面没残留细胞，下表面有紫色的细胞，就说明擦干净了。

四、结果统计：别只数 1 个视野，这样才客观

很多人随便找个视野数细胞，最后数据波动大，审稿人根本不认可。正确的统计方法，要保证 “随机性” 和 “重复性”。

1. 拍照：选 5 个固定视野，避免主观选择

• 这个步骤一般用不到那种精密的实验室仪器，我们把小室放在生物显微镜下，用 10× 物镜（视野大，计数方便），拍上、下、左、右、中 5 个视野（每个视野间距尽量一致），别只拍细胞多的地方 —— 否则数据偏高，不客观。

• 拍照时保持曝光一致：同一个实验的所有样本，曝光时间、焦距都要一样，避免后续分析时因亮度不同导致计数误差。

2. 计数：手动计数 + 软件分析，双重验证

• 手动计数：用 ImageJ 软件打开图片，用 “Cell Counter” 插件，逐个视野数细胞（紫色的细胞核都算），5 个视野取平均值

• 软件分析：如果样本多，可以用 ImageJ 的 “Threshold” 功能，设置合适的阈值（把细胞和背景分开），然后用 “Analyze Particles” 自动计数，最后和手动计数对比，误差在 10% 以内就可以用。

⚠️ 注意：如果细胞重叠太多（比如孵育时间太长），自动计数会不准，必须手动计数，或者在染色前用胰酶把下室的细胞消化下来，用流式细胞仪计数（更准确，但步骤多）。

3. 重复实验：至少 3 次独立重复，别偷懒

• 单个样本做 3 个复孔（比如对照组 3 孔，处理组 3 孔），然后至少做 3 次独立实验（不同天做），最后用 “平均值 ± 标准差（SD）” 表示数据，用 t 检验或 ANOVA 做统计分析 —— 这样数据才有统计学意义，审稿人才会认可。

五、常见问题排查：做不出数据？先看这 5 点

最后总结几个客户常问的问题，帮大家快速定位问题所在：

     其实 Transwell 迁移实验，只要把 “膜的预处理、血清浓度差、细胞状态、计数方法” 这几个关键点把控好，就能稳出数据。如果还有其他问题，比如不知道选哪种孔径的小室，或者需要匹配特定细胞的实验耗材，也可以进入苏州阿尔法生物实验器材有限公司官网咨询我 —— 毕竟我们每天和这些实验耗材打交道，对不同细胞的适配性还是很熟的。

最后提醒一句：实验过程中做好记录（比如细胞浓度、孵育时间、染色时间），下次再做就能直接复用参数，不用再从头摸索啦～

苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年，位于苏州园区生物纳米园（Biobay）A5幢301室。公司管理团队专注于科学仪器行业十四年，拥有专业的技术团队与完善的售后服务体系，目前已为300余家实验室提供优质产品和服务，涵盖各大高校、检测中心、科研机构、制药企业等13个群体。提供的实验室仪器主要包括振荡培养箱，恒温恒湿培养箱、二氧化碳培养箱、生化培养箱、霉菌培养箱、PCR仪，瑞宁移液器，生物反应器，发酵罐，超低温冰箱，液氮罐，高压灭菌器，超纯水机，天平，离心机，离心浓缩仪、研磨机、葡萄糖乳酸分析仪等。厂商企业授权包括知楚仪器、朗基、中科美菱，梅特勒，乐枫，搏旅、NEST、天根、奥盛在内的80个余厂家。