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Mouse ACE ELISA 试剂盒 EK0558

Mouse ACE ELISA 试剂盒 EK0558 血管紧张素I转化酶ELISA试剂盒主要用于体外定量分析鼠血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清。

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● 产品介绍/ product introduction

Mouse ACE ELISA Kit

ELISA 试剂盒

Mouse ACE ELISA 试剂盒 EK0558

产品信息

血管紧张素I 转化酶ELISA 试剂盒

产品编号：EK0558

规格： 96T

检测范围：93.8pg/mlf 6ng/ml。

敏感性： <10pg/ml

特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应。

保存： 2-8℃ (频繁使用时) ；-20℃ (长时间不用时 ) 。

有效期：6个月(4℃) ； 12个月 (-20℃) 。

用途：用于体外定量分析鼠血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清。

● 工作原理/ Principle

Angiotensin I Converting Enzyme, ACE。血管紧张素 I转化酶，是一种锌金属肽酶，对水和盐的代谢及维持血压起重要作用。它切除血管紧张素I的C端二肽，产生具有升压活性的血管紧张素II。同样的机制灭活缓激肽(brandykinin),此外还通过类似的机制在免疫、生育、神经调节方面发挥作用。可溶性 ACE来源于膜型ACE存在于血、羊水、脑脊液等多种体液。

博士德所提供的小鼠ACE ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒(Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA)。预先包被的抗体和检测相抗体都是近100%纯度的亲和纯化多克隆抗体。检测相抗体经生物素 (biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS 或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ACE呈正相关。

● 试剂盒内容参数 / SPECIFICATION

内容	规格	数量
预包被抗小鼠ACE抗体的96孔板	96T	1板
重组小鼠ACE冻干标准品	10ng/管	2管
生物素标记抗小鼠ACE(100X)	100ul	1管
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC ) (100X)	100ul	1管
样品稀释液	30ml	1瓶
抗体稀释液	12ml	1瓶
ABC稀释液	12ml	1瓶
TMB显色液	10ml	1瓶
终止液	10ml	1瓶
洗涤缓冲液(25X)	20ml	1瓶

● 操作及储存/ Content and storage

需要而未提供的试剂和器材

1 .标准规格酶标仪。

2 .自动洗板机。

3,恒温箱

4 .系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。

5 .干净的试管和Eppendof管。

6 .用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。

注意事项

1 .使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与厂家联系。

2 .用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

3 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。

4 .为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。

5 .禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。

6 .本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。

7 .揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品的准备和保存

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

细胞培养上清一一离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

血清一一用干净试管收集血液，室温凝固2小时，离心1000Xg 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

血浆一一用干净试管收集肝素抗凝血液，30分钟内离心，1000Xg 15分钟，收集血浆。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。EDTA或柠檬酸盐抗凝血不适合。

细胞裂解液一一对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10 秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后， 10000—14000g 离心3-5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

试剂的准备和保存

A. ACE标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。

试剂盒提供2管标准品，每管10ng,每次使用1管。

1, 配制10,000pg/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。

2, 配制6000pg/ml标准品：取0.6ml 10,000pg/ml的标准品加入有0.4ml样品稀释液的

Eppendorf管中，混匀，做上标记。

3,配制3000pg/mlf 93.8pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml样品稀释液，分别标记上 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 。取0.3ml 6000pg/ml的标准品加入标记3000pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3ml ,加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。

注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml）,应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，但不得反复冻融。

1 .生物素标记抗小鼠ACE抗体工作液的准备：在使用前2小时内准备。

1 .根据每孔需要100ul计算总的用量（实际配制时应多配制100ul-200ul）。

2 .按1ul生物素标记抗小鼠ACE加抗体稀释液99ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

C.亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。

1 .根据每孔需要100ul计算总的用量（实配时应多配制100ul-200ul）。

2 .按1ul亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

操作程序

己稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

1 .确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时又2。其余重包装好放入冰箱中。

2 . 将 6000pg/ml , 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 的

标准品各100ul依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清，每孔加100ul已用样品稀释液稀释的样品。

1 .酶标板加上封板膜，37。。反应90分钟。

2 .反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。

3 .将准备好的生物素抗小鼠ACE抗体工作液按每孔100ul依次加入。（TMB空白显色孔除外）。酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。

4 . 1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300ul）。

5 .将准备好的ABC工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白显色孔除外）。酶标板加封板膜，37℃反应30分钟。

6 . 1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右（每孔洗液至少300ul）。

7 .按每孔90ul依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应15-20分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。

8 .按每孔100ul依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。

9 .用酶标仪在450nm测定O.D.值。

有两种设定空白对照的方案：

（1）将TMB空白显色孔（只加TMB显色液和终止液）设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。

（2）将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。

12.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。

应记住由于样品稀释了 N倍，其实际浓度应该XN。

操作程序总结：

1 .加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。

2 .加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。

3 .加ABC, 37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。

4 . TMB37℃反应 15-20 分钟。

5 .加入终止液，读数。

典型数据

TMB37℃反应15分钟。

（数据供参考，不同用户最佳显色时间会有所不同）

浓度	0.0pg/ml	93.8pg/ml	187.5pg/ml	375pg/ml	750pg/ml	1500pg/ml	3000pg/ml	6000pg/ml
O.D.	0.088	0.169	0.230	0.315	0.498	0.942	1.447	2.178

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苏州阿尔法生物实验器材有限公司

18年专注生物实验室仪器设备与耗材供应，一级授权代理国内外16大品牌。

苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年，18年专注生物实验室仪器设备和耗材供应，服务1000+客户，覆盖科研院所、医院、疾控中心及制药与食品检测企业。

主营生物安全柜、超净工作台、振荡培养箱、移液器、PCR仪、凝胶成像、超低温冰箱、液氮罐、高压均质机等仪器设备及耗材试剂，提供选型、配送、安装、维保全流程服务。

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