一、细胞解冻方法：

准备一个培养培养瓶，使其包含产品说明书中列出的推荐体积的适当培养基，并针对温度和 pH (CO 2 )进行平衡。

在 37°C 或该细胞系的正常生长温度下，在水浴中轻轻搅拌解冻小瓶。解冻应该很快，大约 2 分钟或直到冰晶融化。

从水浴中取出小瓶，并通过浸入或喷洒 70% 乙醇来净化。在层流组织培养罩中遵循严格的无菌条件进行所有进一步操作。

拧下小瓶的顶部并将内容物转移到含有 9 mL 推荐培养基的无菌离心管中。通过温和离心（125 × g 10 分钟）去除冷冻保护剂 (DMSO)。丢弃上清液，将细胞重悬于 1 或 2 mL 完全培养基中。将细胞悬浮液转移到含有完全生长培养基的培养培养瓶中，并通过轻轻摇动彻底混合。

24 小时后检查细胞培养物，并根据需要进行继代培养。

这里需要注意的是：一些细胞系可能需要几天时间才能从冷冻保存中完全恢复。比如：一些杂瘤细胞在培养的第一天活力很差，会产生细胞碎片。解冻后，细胞将开始恢复并进入指数增长。

二、解冻后的细胞处理：

一些细胞供货商为保证成活率，会解冻后进行发货运输。这些培养瓶用细胞接种，孵育以确保细胞生长，然后填充培养基以进行运输。

收到细胞培养物后，需要目视检查培养基是否存在微生物污染的宏观证据。这包括异常的 pH 值变化（酚红的黄色或紫色）、浑浊或颗粒。使用低倍率 (100×) 的倒置显微镜检查培养基是否存在微生物污染的证据以及细胞的形态。

如果细胞贴壁并以单层生长：

• 如果细胞已经贴附并形成单层，可能需要维持细胞的生长状态和健康状态，以便继续进行下一步实验或分析。以下是一些建议来维护单层细胞的生长和健康状态：
• 保持培养基的新鲜和适当的营养：必须经常更换液体培养基，以保持适当的pH，渗透压和营养素含量。常用的方式是定期检查培养基的酸碱度和滴定度，做好消毒和表面清洁，防止细菌、真菌、病毒的交叉感染。
• 检查和调整环境参数：为了维护细胞的生长状况，必须保证细胞在适当的环境因素下培养。推荐将细胞培养于CO2孵化器中，温度保持在37摄氏度下。定期检查温度、湿度和气体氧气浓度，以便使它们符合细胞类型的要求。
• 定期更换培养基：细胞每一到两天将需要更换培养基，以便消除可能产生的有害代谢产物、细胞分泌物和悬浮物。这还可以帮助保持适当的pH和离子浓度，并提供营养物质来促进细胞增殖和扩增。
• 定期找出并处理细胞培养中的污染：如果发现细胞培养中存在污染的迹象，需要立即找出并处理。建议采取逆向染色方法，比如酚红染色，而不是道理西的吉姆萨染色，以避免影响细胞健康和形态。处理污染将需要使用抗生素、抗真菌和抗病毒药物等，但必须谨慎使用，以避免对细胞的毒性和不良影响。
• 监测细胞增殖和活性：对于已经贴壁并形成单层的细胞，可以使用视觉方式或其他方法监测细胞的增殖和活性。例如，可以检测细胞形态、颜色和密度，以了解细胞数量和健康状态。建议采用背景熄灭的方法来观察细胞的数量和活性，比如MTT、CCK-8等方法。

大多数细胞系开始于原代培养物，原代培养物来源于一块切碎的或酶分散的组织。原代培养物作为几种细胞类型的混合物，保留了它们来源组织的特征。

一段时间后，原代培养物将达到汇合状态，即由于细胞扩张而覆盖培养培养瓶所有可用空间的状态。此时，需要将培养物分解（通常使用胰蛋白酶等蛋白水解酶）为单个细胞并进行传代培养（分裂、传代或转移）。在1次传代之后，培养物通常被称为细胞系。随着随后的每次传代培养，细胞群变得更加均匀，因为生长更快的细胞占主导地位。也可以通过克隆从培养物中选出具有所需特性的细胞。

二倍体细胞系很少会超过几次群体倍增。它们的复制能力有限，在 20 到 80 次种群倍增后开始减慢并停止分裂。

有的证据表明，在细胞培养中观察到的一些细胞衰老可能是由于不适当的培养条件，而不是预定的复制衰老。

还有其他数据支持某些物种（尤其是人类）的细胞即使在改良的培养条件下生长也会出现复制性衰老。这种衰老是由每次细胞分裂时染色体末端（端粒）的缩短介导的。

相反，连续（或永生化）细胞系具有无限的复制能力。这些细胞系通过多种方式中的任何一种通过永生化或转化衍生自细胞系。许多连续细胞系来源于肿瘤组织。 集合中的大多数细胞系是连续的，尽管少数细胞系是有限的，例如 CCD-1117Sk 人皮肤成纤维细胞 (  CRL-2465 ) 或 CCD-18Co 人结肠 (  CRL-1459 )。

 细胞传代培养步骤：细胞的生长方式主要有两种，即：贴壁生长和悬浮生长。当细胞在单层或悬浮液中生长和分裂时，它们通常遵循由四个阶段组成的特征性生长模式：滞后、对数或指数、静止或平稳和下降。

l 停滞期——在培养培养瓶接种后，细胞立即缓慢生长，同时从传代培养的压力中恢复过来。

l 对数或指数期——细胞进入指数生长期，一直持续到整个生长表面被占据或细胞浓度超过培养基的容量。

l 静止期——细胞增殖减慢并停止。

l 衰退期——如果不更换培养基且细胞数量不减少，细胞就会失去活力，数量也会减少。

l 为确保活力、遗传稳定性和表型稳定性，细胞系需要维持在指数期。这意味着它们需要在进入稳定生长期之前、在单层细胞达到 100% 汇合之前或在悬浮液达到其最大推荐细胞密度之前定期进行传代培养。为每个细胞系生成生长曲线有助于确定细胞系的生长特征。

传代数和群体倍增水平

原代培养物通常以 1:2 的比例传代（每次传代时将它们分成两半）。大多数连续细胞系以更高的速率复制，并以更高的分流比进行传代培养。传代数通常是细胞传代培养到新容器中的次数。对于二倍体培养，传代数大致等于自培养开始以来的群体倍增次数（或群体倍增水平，PDL）。这不是连续细胞系的情况，因为它们以更高的分流比传代。因此，PDL 未针对连续细胞系确定。在大多数情况下，PDL 是一个估计值，因为它不考虑任何因坏死或细胞凋亡死亡或接近衰老且不再分裂的细胞而丢失的细胞。

PDL = 3.32 (log Xe – log Xb) + S

Xb 是孵育开始时的细胞数。

Xe 是孵育时间结束时的细胞数。

S 是起始 PDL。

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