HeLa细胞全基因组CRISPR筛选对病原侵染机制研究

研究背景

·  近年来，由于超级毒力菌株的出现和广泛传播，CDI的全球负担有所加剧。艰难梭菌产生三种致病性相关的外毒素：毒素A（ TcdA ）、毒素B（TcdB）和艰难梭菌转移酶（CDT）。

·  在这三种毒素中，TcdB在引起胃肠道疾病中起着关键作用。TcdB是艰难梭菌的主要毒性因子，分为至少8个自然变种/亚型，其中1-4型与人类疾病相关。

·   第二群（clade 2）艰难梭菌，也称为超级毒力群，仅表达两种TcdB变种（TcdB2和TcdB4），这些变种不识别经典的Frizzled（FZD）受体。目前还不清楚这些TcdB变种如何靶向肠上皮细胞引发组织损伤。

研究思路

功能验证： 为了验证TFPI在体内是否是TcdB4的受体，研究人员使用了TFPI敲除的小鼠模型，并在小鼠结肠环扎模型中测试了TFPI对TcdB4介导的肠道损伤的保护作用。

策略的探索： 最后，研究人员探索了同时抑制TFPI和CSPG4两种受体结合位点的方法，以提供合适的TcdB保护效果。

• 细胞病变细胞圆润化测定 (cytopathic cell-rounding assays)：一种实验方法，用来检测毒素等物质对细胞的影响，通常是通过观察细胞形态变化（如变圆）来评估细胞毒性。
• CR50：指引起50%细胞圆润化的毒素浓度，50%为标准   衡量不同细胞系在病毒侵染筛选下的细胞敏感性.

• 在HeLa细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选，GeCKO v2向导RNA ( gRNA )文库并进行3轮TcdB4选择

2. NGS进行解码对识别的基因进行排序和绘图，标记出至少靶向三个gRNA的富集基因前30个。

• 细胞表面蛋白TFPI（组织因子途径抑制物）： 是一种在人体内参与血液凝固调控的蛋白质。它主要存在于细胞膜上和细胞外空间 ，TFPI（组织因子途径抑制物）的不同形式，可能与毒素进入细胞的过程相关。

• CSPG4、FZD1-2-7、TFPI： 这些都是细胞表面的蛋白质，与细胞对TcdB4的敏感性有关。

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4. TcdB4对HeLa细胞的毒性机制通过和细胞表面结合发挥作用，膜蛋白TFPI和CSPG4正向调控，TFPI作用尤为明显。

• PI-PLC： 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C），是一种影响细胞信号传导的酶，，能够切割磷脂分子并释放GPI-锚定的蛋白质。

• RAC1糖基化：指的是RAC1蛋白质的一种翻译后修饰，这里用作评估毒素作用的一个指标。

6. TFPIK1+K2（效应子）加量后可以使TcdB4侵染HeLa CSPG4/使细胞血红蛋白运输加快 ，且受 细胞膜表面CSPG4正向调控。

C 系统发育分析显示，TFPIK2的一级序列与TFPIK1的亲缘关系最为密切，相似性67.9%

• TFPIa在介导TcdB4的细胞进入方面具有二元效应，由于TFPIa和TFPIb都可以介导TcdB4的结合-进入，推测TcdB4与TFPI的K1和K2结构域（TFPIK1+K2）相互作用。

  
  

7. TcdB4中L1599、K1435、L1434、V1492、L1494、M1438和D1468的点突变取消了TFPI结合能力，表明这些位置对受体识别很重要（TcdB4毒力因子识别位点）。

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