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1 -戴干净的手套；
2 -用75%酒精清洗移液管和支架；
3 -解冻DNA样本和所有试剂（（2×TaqMan基因表达主混合液（Applied BioSystems）、引物（10 μM）和探针（10 μM）)；
4 -轻轻混合DNA样品，并在涡旋器上充分混合试剂。
5 -用离心机对DNA样品和试剂进行离心； 6 -试剂置于冰上；
7 -标记微管，使其准备好用于混合物的制备。
8 -所需设备：ABI Step One Plus实时PCR系统（Applied BioSystems） 9 -所需耗材：96孔板（100ul）
反应设置
1 -根据表1中的指南，制备所需反应次数的反应混合物。组装除样品外的 所有所需组件，将等量的样品分配到每个反应孔中，并在最后一步向每个反应 管中加入样品。
表1.反应混合物的制备。
|
组件 |
每次反应的体积， μ l |
规格 |
|
2×TaqMan基因表达Master Mix |
10 |
1 × |
|
（10 μM）正向引物 |
1.8 |
900nM |
|
（10 μM）反向引物 |
1.8 |
900nM |
|
（10 μM）探头 |
0.5 |
250nM |
|
样本DNA |
4 |
|
|
无RNase/DNase的水 |
1.9 |
|
|
总量 |
20 |
|
2 -在旋涡中充分混合平板，然后短暂离心。
热循环条件
对于朗基荧光定量 PCR 仪，热循环条件补充如下：
|
温度（℃） |
时间 |
循环次数 |
|
50 |
2 min |
1 |
|
95 |
10 min |
1 |
|
95 |
15 sec |
40 |
|
60 |
60 sec |
40 |
使用朗基荧光定量 PCR 仪配套的分析软件（具体版本以仪器实际配置为准）分析荧光累积数据。操作时，可先将实验数据导入软件，通过设置基线范围、阈值等参数，软件会自动识别荧光信号的变化趋势，进而完成对目标基因的定量分析（如计算 Ct 值、绘制标准曲线等）。
详细操作可参照朗基荧光定量 PCR 仪的用户手册，以确保参数设置符合实验要求，获得准确的分析结果。
苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年，位于苏州园区生物纳米园（Biobay）A5幢301室。公司管理团队专注于科学仪器行业十八年，拥有专业的技术团队与完善的售后服务体系，目前已为300余家实验室提供优质产品和服务，涵盖各大高校、检测中心、科研机构、制药企业等13个群体。提供的实验室仪器主要包括振荡培养箱，恒温恒湿培养箱、二氧化碳培养箱、生化培养箱、霉菌培养箱、PCR仪，瑞宁移液器，生物反应器，发酵罐，超低温冰箱，液氮罐，高压灭菌器，超纯水机，天平，离心机，离心浓缩仪、研磨机、葡萄糖乳酸分析仪等。厂商企业授权包括梅特勒-瑞宁Rainin 、知楚&搏旅、海尔 、杭州朗基、上海天能胶成像仪、恒尔离心机,杭州奥盛、EKF葡萄糖乳酸分析仪、小鳄Gator 、耐思NEST、天根、 海星、哈爵雅消毒液等厂家；进口品牌包括：Thermo、METTLER TOLEDO、Eppendorf、PerkinElmer、Beckman、Merk Millipore、Agilent、BMG、Tecan、Sartorius等。
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