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  • cck8试剂
CCK8细胞增殖和活性检测试剂盒-cck8法检测细胞活力- cck8试剂-碧云天生物

用于生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞增值的测定、细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便,试剂盒包含一管已经配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液,即开即用,无需其他准备步骤。

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    CCK-8 细胞增殖与活性检测试剂盒- cck8法检测细胞活力

CCK-8细胞毒性检测试剂盒

    货号 规格
     BDXB0002-5  5ml
     BDXB0002-10  10ml
     BDXB0002-30  30ml

    产品概述

           CCK-8(Cell Counting Kit-8)是一种基于WST(水溶性四唑盐,一种类似于MTT的化合物)的细胞增殖与活性检测试剂盒,用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测。在电子耦合试剂存在的情况下,WST被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料(formazan),甲臜染料直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快,则培养基的颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,生成甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
     
    用途
           用于生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞增值的测定、细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便,试剂盒包含一管已经配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液,即开即用,无需其他准备步骤。检测过程也无需采用额外的步骤去溶解甲臜,可直接使用96孔板或者384孔板在酶标仪上检测,适合大规模,高通量的样品检测。

    CCK-8与MTT法的比较
    CCK-8 MTT
     还原后的甲臜是水溶性的(不需要溶解)  还原后的甲臜是非水溶性的(需要加有机溶剂溶解)
     重现性好  重现性差
     操作简单  操作繁琐
     测定波长:450-490nm  测定波长:550-600nm
     单一溶液,即开即用  需要加有机溶剂,有毒性


    参考数据

    (1)CCK-8与MTT、XTT、MTS试剂盒比较图
    CCK-8和MTT比较
    (2)博奥龙CCK-8与其它公司产品比较图
    CCK-8细胞活性检测

    使用方法

     一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时)

     1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。

    2. 按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个 细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。 

    3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值,制作出 一条以细胞数量为横坐标,OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未 知样品的细胞数量(适用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,尤其加入CCK-8后的 培养时间要一致)。

    二、细胞活性检测 1. 在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)。

    1.将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。

    2. 向每孔加入10μl的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,以免影响OD的读数)。 

    3. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 

    4. 用酶标仪测定450nm处的吸光度。 

    5. 如果暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μl的0.1M的HCl溶液或1% w/v SDS溶液, 并遮盖培养板避光室温保存,24小时内吸光度不会发生变化。 

    三、细胞增殖-毒性检测(以96孔板为例) 

    1. 在96孔板中配置100μl的细胞悬液(通常细胞增殖实验每孔加入100μl约2000个细胞,细 胞毒性实验每孔加入100μl约5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的 大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要,进行预培养。 

    2. 向培养板加入1-10μl不同浓度的待测药物刺激。

    3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(后面有具体细胞的建议时间,例如:6、12、 24或48小时)。

    4. 每孔加入10μl的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,以免影响OD读数)。如果起 始的培养体积为200μl,则需加入20μl CCK-8溶液,其他情况以此类推。可以用加了相 应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物 会干扰检测,需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作 为空白对照。 

    5. 在细胞培养箱内继续孵育1-4小时(对于大多数情况孵育1小时就可以)。时间的长短根 据细胞的类型和细胞的密度等情况而定,初次实验时可以在0.5、1、2 和4小时候分别 用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。 

    6. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。可以使用大于600nm的波长,例如650nm,作为参 考波长进行双波长测定。 

    7. 如果暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液, 并遮盖培养板避光室温保存,24小时内吸光度不会发生变化。 

    注意:如果待测物质有氧化或还原特性,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(先用培养 基洗涤细胞两次),去掉药物影响。如果药物影响比较小,可以不更换培养基,直接扣 除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 

    活力计算

     细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0 加药)-A(空白)] ×100 A

    (加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A

    (空白):具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A

    (0 加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力 

    注意事项

    1. 由于使用96孔板进行检测,如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发的问题。一方面, 由于96孔板周围一圈最容易蒸发,可以采取弃用周围一圈的办法,改加PBS,水或培养 液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。 

    2. CCK-8检测细胞活性原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂,例一些抗氧化剂会干扰检测,需设法去除。

    3. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

     4. 建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时,建议斜贴着培 养板壁加,不要查到培养基液面下加样,溶液产生气泡,会干扰OD读数。

     5. 当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔(100μl培养基)。检测 白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2500个/孔(100μl培养基),且培 养时间长一些。如果要使用24孔板或6孔板实验,需先计算每孔相应的接种量,并按照 每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。 

    6. 加入CCK-8溶液时,如果细胞培养时间较长,培养基颜色已变化或pH值变化,建议换 用新鲜的培养基。 

    7. 如果没有450nm的滤光片,可以使用吸光度在450-490nm之间的滤光片,但是450nm滤 光片的检测灵敏度最高。

    8. 酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过 扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

    9. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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