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  • Mouse ACE ELISA 试剂盒  EK0558

Mouse ACE ELISA 试剂盒 EK0558

 Mouse ACE ELISA 试剂盒  EK0558 血管紧张素I转化酶ELISA试剂盒 主要用于体外定量分析鼠血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清。
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● 产品介绍/ product introduction
Mouse ACE ELISA Kit 


ELISA 试剂盒

 Mouse ACE ELISA 试剂盒  EK0558

            产品信息 


血管紧张素I 转化酶ELISA 试剂盒

产品编号:EK0558

规格: 96T

检测范围:93.8pg/mlf 6ng/ml。

敏感性: <10pg/ml

特异性: 系统和其它细胞因子无交叉反应。

保存: 2-8℃ (频繁使用时) ;-20℃ (长时间不用时 ) 。

有效期:6个月(4℃) ; 12个月  (-20℃) 。

用途: 用于体外定量分析鼠血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清。

● 工作原理/ Principle

Angiotensin I Converting Enzyme, ACE。血管紧张素 I转化酶,是一种锌金属肽酶,对水和 盐的代谢及维持血压起重要作用。它切除血管紧张素I的C端二肽,产生具有升压活性的 血管紧张素II。同样的机制灭活缓激肽(brandykinin),此外还通过类似的机制在免疫、生 育、神经调节方面发挥作用。可溶性 ACE来源于膜型ACE存在于血、羊水、脑脊液等多 种体液。

博士德所提供的小鼠ACE ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒(Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA)。预先包被的抗体和检测相抗体都是近100%纯度的 亲和纯化多克隆抗体。检测相抗体经生物素 (biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加 入酶标板孔反应后,PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经过PBS 或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸 的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ACE呈正相关。

● 试剂盒内容参数  / SPECIFICATION

内容

规格

数量

预包被抗小鼠ACE抗体的96孔板

96T

1

重组小鼠ACE冻干标准品

10ng/

2

生物素标记抗小鼠ACE(100X)

100ul

1

亲和素-过氧化物酶复合物(ABC ) (100X)

100ul

1

样品稀释液

30ml

1

抗体稀释液

12ml

1

ABC稀释液

12ml

1

TMB显色液

10ml

1

终止液

10ml

1

洗涤缓冲液(25X)

20ml

1


● 操作及储存/ Content and storage

    需要而未提供的试剂和器材

    .标准规格酶标仪。

    .自动洗板机。

    3,恒温箱

    .系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器。

    .干净的试管和Eppendof管。

    .用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍,成1X洗涤缓冲液。

    注意事项

    .使用前TMB显色液应为无色透明溶液,若发现颜色异常,请及时与厂家联系。

    .用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。

    要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。

    .为免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和试管。

    .禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。

    .本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板,用户可按需求使用;剩余的酶标板请 按保存条件贮存。

    .揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

    洗板方法

    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水 纸,酶标板朝下用力拍几次;将1X洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据 需要,重复此过程数次。

    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

    样品的准备和保存

    样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。

    细胞培养上清一一离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

    血清一一用干净试管收集血液,室温凝固2小时,离心1000Xg 15分钟,收集血清。立即 分析或分装后-20℃冷冻保存。

    血浆一一用干净试管收集肝素抗凝血液,30分钟内离心,1000Xg 15分钟,收集血浆。立 即分析或分装后-20℃冷冻保存。EDTA或柠檬酸盐抗凝血不适合。

    细胞裂解液一一对于贴壁细胞,去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。 加入适量裂解液,用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常10 秒后,细胞就会被裂 解。对于悬浮细胞,离心收集细胞,用PBS、 生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量 裂解液,用枪吹打把细胞吹散,用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后, 10000—14000g 离心3-5分钟,取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

    试剂的准备和保存

    A. ACE标准品的稀释和使用:在使用前2小时内准备。

    试剂盒提供2管标准品,每管10ng,每次使用1管。

    1,  配制10,000pg/ml标准品:取1ml样品稀释液加入标准品管内,盖好后静置10分钟以 上,然后反复颠倒/搓动以助溶解。

    2,  配制6000pg/ml标准品:取0.6ml 10,000pg/ml的标准品加入有0.4ml样品稀释液的

    Eppendorf管中,混匀,做上标记。

    3,配制3000pg/mlf 93.8pg/ml标准品:准备6只Eppendorf管,每管加0.3ml样品稀释 液,分别标记上 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 。 取0.3ml 6000pg/ml的标准品加入标记3000pg/ml的管中,混匀后同样取出0.3ml ,加入 下一只管中。余同此类推,直到最后一只样品管。

    注意:已经稀释的标准品(10,000pg/ml),应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件 下,2天内可以使用,但不得反复冻融。

    .生物素标记抗小鼠ACE抗体工作液的准备:在使用前2小时内准备。

    .根据每孔需要100ul计算总的用量(实际配制时应多配制100ul-200ul)。

    .按1ul生物素标记抗小鼠ACE加抗体稀释液99ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

    C.亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备:在使用前1小时内准备。

    .根据每孔需要100ul计算总的用量(实配时应多配制100ul-200ul)。

    .按1ul亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99ul的比例配制工作液。轻 轻混匀。

    操作程序

    己稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。 试剂或样品稀释时,切不可忘记混匀 。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测 因子的含量,决定适当的稀释倍数。

    .确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目,并增加1孔作为TMB空白显色 孔。总数=样品数+9;做双份检测时又2。其余重包装好放入冰箱中。

    . 将 6000pg/ml , 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 的

    标准品各100ul依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、 血浆、细胞裂解液或细胞培养上清,每孔加100ul已用样品稀释液稀释的样品。

    1 .酶标板加上封板膜,37。。反应90分钟。

    2 .反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几 下。不洗。

    3 .将准备好的生物素抗小鼠ACE抗体工作液按每孔100ul依次加入。(TMB空白显色孔 除外)。酶标板加上封板膜,37℃反应60分钟。

    4 . 1X洗涤缓冲液洗涤3次,每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300ul)。

    5 .将准备好的ABC工作液按每孔100ul依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加封 板膜,37℃反应30分钟。

    6 . 1X洗涤缓冲液洗涤5次,每次浸泡1-2分钟左右(每孔洗液至少300ul)。

    7 .按每孔90ul依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液,37℃避光反应15-20分 钟(注意:显色时间供参考,因用户实验室条件差异,最佳显色时间会有所不同。此 时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔差别不明显)。

    8 .按每孔100ul依次加入终止液,此时蓝色立转黄色。

    9 .用酶标仪在450nm测定O.D.值。

    有两种设定空白对照的方案:

    (1)将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样 品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后,在坐标纸上画出曲线,以吸光值作为 纵坐标,以浓度作为横坐标。

    (2)将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后,得到的数 据可以直接在坐标纸上画出曲线。

    12.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。

    应记住由于样品稀释了 N倍,其实际浓度应该XN。



    操作程序总结:

    1 .加样品和标准品,37℃反应90分钟。不洗。

    2 .加生物素标记抗体,37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。

    3 .加ABC, 37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。

    4 . TMB37℃反应 15-20 分钟。

    5 .加入终止液,读数。

    典型数据

    TMB37℃反应15分钟。

    (数据供参考,不同用户最佳显色时间会有所不同)

    浓度

    0.0pg/ml

    93.8pg/ml

    187.5pg/ml

    375pg/ml

    750pg/ml

    1500pg/ml

    3000pg/ml

    6000pg/ml

    O.D.

    0.088

    0.169

    0.230

    0.315

    0.498

    0.942

    1.447

    2.178

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