重组蛋白质在生物医学研究和产业应用中具有广泛的用途。为了获得高质量的重组蛋白质，需要进行一系列的操作，包括表达、纯化、复性和定量。本文将详细介绍按照试剂盒操作手册进行的步骤，以帮助读者全面了解重组蛋白质的处理流程。

一、重组蛋白质的诱导表达：

1. 挑取转化有质粒的单菌落，接种于选择性LB液体培养基中，在37°C、250 rpm的条件下振摇培养过夜。

2. 次日将培养过夜的菌液用1:20的比例接种于选择性LB液体培养基中，在37°C、250 rpm的条件下培养至光密度（OD600=0.6）。取1 ml样本作为诱导前标本，以备后续分析。

3. 加入1 mol/L IPTG至菌液中，使终浓度为1 mM，在37°C、250 rpm的条件下继续振摇培养4~5小时。取1 ml样本作为诱导后标本，收集菌体沉淀并冻存备用。

4. 将诱导前后的菌体沉淀用20~40 μl PBS（pH=8.0）重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，进行煮沸加热5 min后进行SDS-PAGE电泳分离。参照考马斯亮蓝染色法观察结果。

二、重组蛋白质的分离纯化：

重组蛋白质的可溶性鉴定：

1. 将按上述方法诱导培养后的菌体用裂解液1（Lysis buffer under native conditions）重悬，并在-80°C低温冰箱中置放10 min。

2. 冰中解冻。

3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌6次，每次10 sec，间歇10 sec，电压200-300 V。

4. 以10000g、4°C离心20min，收集上清液（溶液A），冻存于-20°C备用；将沉淀用同样的裂解液1溶解（溶液B），同样冻存于-20°C，供后续分析使用。

5. 将溶液A、溶液B和诱导前后的细菌进行SDS-PAGE电泳，采用考马斯亮蓝染色方法，比较分析重组蛋白质的溶解性。如果蛋白质溶解于溶液A中，则为可溶性蛋白；如果溶解于溶液B中，则为非可溶蛋白。

重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化：

1. 将菌体沉淀溶解于适量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions），在室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2. 以10000g、4°C离心30 min，收集上清液。

3. 将Ni-NTA Agarose充填至柱子中，并连接于Pharmarcia低压液相层析系统，用5倍柱体积的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，并调节A280值至零线。

4. 将适量上清液上样至Ni-NTA Agarose柱中，并用裂解液清洗至A280值低于0.01。

5. 使用清洗液1和清洗液2分别进行5~10倍柱体积的洗脱，直至A280值低于0.01。

6. 使用洗脱液（Elution buffer）洗脱重组蛋白质，进行A280值监测，并收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

三、重组蛋白质的复性、冻干和定量：

1. 对纯化后的蛋白质进行梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终使用0.01×PBS进行透析。

2. 透析后的蛋白质溶液进行冻干，使其成粉状。

3. 使用BIO-RAD公司的蛋白质定量试剂，以牛血清白蛋白（BSA）为标准，采用比色测定方法进行蛋白质含量的定量。

重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量是获得高质量重组蛋白的关键步骤。这些步骤能够帮助研究人员获得高纯度和活性的重组蛋白质，为后续的实验和应用奠定基础。

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