信息摘要：
在荧光定量 PCR 实验里，无 Ct 值出现和 Ct 值过晚是常让科研人员头疼的问题。
在荧光定量 PCR 实验里，无 Ct 值出现和 Ct 值过晚是常让科研人员头疼的问题。这些问题会严重干扰实验结果的准确性与可靠性，接下来我们就深入探讨下背后的原因和解决办法。
一、无 Ct 值出现的原因及解决办法
（一）循环数设置不合理
正常情况下，PCR 循环数一般不宜超过 45 循环。要是循环数设置不足，可能因扩增产物量不够，荧光信号没达到可检测水平，导致无 Ct 值。比如在一些低拷贝数模板的检测中，若循环数只设 30 次，很可能就检测不到产物。
解决办法：依据实验经验和模板预估量，合理增加循环数，不过要注意，循环数过高也会使背景值提高，定量不准，通常调整到 35 - 40 循环较为合适。
（二）PCR 程序里检测荧光信号步骤有误
不同荧光定量方法，采集荧光信号的时机有别。像 SG 法一般在 72℃延伸时采集，TaqMan 法则多在退火结束或延伸时采集。要是 PCR 程序设置时，荧光采集步骤和所用方法不匹配，或者压根没勾选荧光采集选项，那肯定检测不到荧光信号，也就没有 Ct 值。
解决办法：仔细核对所用荧光定量方法的说明书，严格按要求设置 PCR 程序里荧光信号检测步骤，确保准确采集荧光信号。
（三）引物或探针降解
引物或探针降解后，无法正常和模板结合并引导扩增，自然不会有扩增产物，也就无 Ct 值。可通过 PAGE 电泳检测引物和探针是否降解，降解的引物或探针在电泳图上会呈现出条带模糊、拖尾等异常。
解决办法：重新合成高质量引物和探针，注意引物和探针的保存条件，避免反复冻融，最好小量分装，存放在 - 20℃或 - 80℃。
（四）模板降解或上样量不足
模板降解，完整性被破坏，扩增难以进行；上样量不足，起始模板拷贝数少，扩增产物量也会很少，导致荧光信号弱，检测不到 Ct 值。一般模板上样量不超 500ng，对未知浓度样本，应从系列稀释样本的最高浓度开始实验。另外，样本准备过程中引入杂质、反复冻融，都可能造成模板降解。
解决办法：优化样本提取和保存方法，确保模板质量。提取后尽快实验，如需保存，将模板样本小量分装储备，避免反复冻融。实验前，用核酸定量仪精确测定模板浓度，依据浓度调整上样量。
（五）引物探针设计不合理
引物设计要是不合理，像上下游引物 Tm 值差异超 4℃，会影响扩增效率，甚至导致扩增失败，没有 Ct 值；引物若不能跨越内含子，扩增基因组 DNA 时，可能受内含子干扰，影响结果。
解决办法：借助专业引物设计软件，如 Primer Premier 5.0 等，精心设计引物。设计好后，进行 BLAST 比对，确保引物特异性，避免与其他基因序列有过多同源性。
二、Ct 值过晚的原因及解决办法
（一）扩增效率低
-
引物间或引物与探针比例不当：引物和探针浓度不合适，比如引物浓度过高，可能形成引物二聚体，竞争模板结合位点，降低扩增效率；引物和探针比例失衡，也会影响扩增。
解决办法：通过预实验，优化引物和探针浓度及比例，摸索出最佳反应体系。
-
引物或探针设计不合理：引物长度、GC 含量、特异性等不合适，都可能致使扩增效率低，Ct 值过晚。比如引物长度过长，退火时难以和模板完全配对，影响扩增。
解决办法：重新设计引物和探针，保证引物长度适中（一般 18 - 25bp），GC 含量在 40% - 60%，同时具备高特异性。
（二）PCR 程序不合适
-
改用三步法反应：两步法反应中，退火和延伸在同一温度进行，可能对某些模板和引物组合效果欠佳。三步法将退火、延伸分开，能更好优化反应条件。
解决办法：尝试将 PCR 程序改为三步法，即变性、退火、延伸分别在不同温度下进行，依据引物 Tm 值，合理设置退火温度。
-
优化退火 / 延伸温度：退火温度过高，引物和模板结合不充分；过低，易产生非特异性扩增。延伸温度不合适，会影响 Taq 酶活性和扩增效率。
解决办法：以引物 Tm 值为参考，适当降低退火温度（一般降低 3 - 5℃），优化延伸温度（通常 72℃左右），通过预实验确定最佳温度。
-
延长退火 / 延伸时间：退火或延伸时间过短，引物和模板结合不充分，扩增产物合成不完全，导致 Ct 值过晚。
解决办法：在推荐时间基础上，适当延长退火 / 延伸时间 10s 左右，观察扩增效果。
（三）MgCl₂浓度不合适
Mg²⁺是 Taq 酶活性必需离子，浓度过高或过低，都会影响 Taq 酶活性和扩增效率。浓度过高，可能增加非特异性扩增；过低，Taq 酶活性受抑制。
解决办法：依据所用 PCR 试剂盒推荐，适当调整 MgCl₂浓度，通过预实验确定最适浓度。
（四）PCR 产物过长
PCR 产物设计超过 500bp，扩增难度会增加，所需时间更长，导致 Ct 值过晚。因为长片段扩增对反应条件要求更严苛，容易出现扩增效率低的问题。
解决办法：重新设计引物，缩短 PCR 产物长度，一般控制在 100 - 300bp，更利于高效扩增。
（五）模板中存在抑制物
模板提取过程中，若混入蛋白质、多糖、有机溶剂等杂质，这些物质可能抑制 Taq 酶活性，降低扩增效率，使 Ct 值过晚。
解决办法：使用高纯度模板进行 PCR 检测，或对模板进行稀释，降低抑制物浓度。也可采用模板纯化试剂盒，进一步去除杂质。
更多关于荧光定量 PCR 仪原理、荧光定量 PCR 仪品牌、荧光定量 PCR 仪价格、实时荧光定量 PCR 技术、荧光定量 PCR 实验步骤等
实验室仪器，
实验耗材，生物试剂相关问题，欢迎进入苏州阿尔法生物实验器材有限公司网站进行了解，或者0512-62956104进行咨询。
苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年，位于苏州园区生物纳米园（Biobay）A5幢301室。公司管理团队专注于科学仪器行业十四年，拥有专业的技术团队与完善的售后服务体系，目前已为300余家实验室提供优质产品和服务，涵盖各大高校、检测中心、科研机构、制药企业等13个群体。提供的实验室仪器主要包括振荡培养箱，恒温恒湿培养箱、二氧化碳培养箱、生化培养箱、霉菌培养箱、PCR仪，瑞宁移液器，生物反应器，发酵罐，超低温冰箱，液氮罐，高压灭菌器，超纯水机，天平，离心机，离心浓缩仪、研磨机、葡萄糖乳酸分析仪等。厂商企业授权包括知楚仪器、朗基、中科美菱，梅特勒，乐枫，搏旅、NEST、天根、奥盛在内的80个余厂家。
