细胞共培养小室是实验室中用于模拟体内细胞间相互作用、实现不同类型细胞 “同环境分隔培养” 的专用工具，核心作用是在同一培养体系内物理分隔细胞，同时允许营养物质、信号分子等小分子自由流通，还原更接近生理状态的细胞研究环境。

一、基本定义与核心结构

细胞共培养小室通常为模块化设计，可适配常规细胞培养皿 / 板（如 6 孔、12 孔、24 孔板），核心结构分为三部分：

上室（Insert）：用于接种一种细胞，底部为多孔滤膜，是实现 “分隔” 与 “交流” 的关键部件。

下室（Well）：即培养板的基础孔，用于接种另一种细胞，与上室共用同一份培养基。

滤膜：决定共培养小室的核心功能，关键参数包括：

孔径：常见 0.4μm（允许小分子、细胞因子通过，阻止细胞迁移）、8.0μm（允许细胞迁移 / 侵袭，用于肿瘤转移、细胞趋化实验）。

材质：聚酯（PET）膜（透光性好，适配荧光显微镜观察）、聚碳酸酯（PC）膜（耐化学性强，适合长期培养）。

二、核心功能与研究价值

实现 “非接触式共培养”：物理分隔两种细胞，避免直接接触，仅通过培养基中的信号分子（如细胞因子、生长因子）研究旁分泌效应。

例：研究干细胞分泌的因子对肿瘤细胞增殖的影响，无需担心两种细胞混合。

模拟生理微环境：还原体内不同细胞 “相邻但不融合” 的状态，如上皮细胞与间质细胞、免疫细胞与靶细胞的相互作用。

开展特殊功能实验：搭配不同孔径滤膜，可拓展为细胞迁移实验（Transwell 迁移）、细胞侵袭实验（Matrigel 包被滤膜），研究细胞的运动能力。

一、核心参数选型表：1分钟匹配实验需求

二、主流小室操作步骤：标准化流程

（一）Transwell小室操作（以肿瘤侵袭实验为例）

1. 实验前准备：  

￮ 小室处理：选择8.0μm孔径透明PET膜小室，用无血清培养基浸泡膜30分钟（激活膜亲水性）。  

￮ Matrigel包被：按1:8比例用无血清培养基稀释Matrigel，每孔加50-100μL（覆盖膜上表面），37℃孵育4-6小时至胶凝固。  

2. 细胞铺板：  

￮ 上室：接种肿瘤细胞（密度1×10⁴ cells/孔，用无血清培养基悬浮），避免产生气泡（气泡会导致细胞无法贴壁）。  

￮ 下室：加入含10%血清的培养基（作为趋化因子来源），液面需与上室膜下表面接触（确保分子能穿透膜）。  

3. 培养与观察：  

￮ 37℃、5%CO₂培养24-48小时（根据细胞侵袭能力调整时间）。  

￮ 结果检测：取出小室，用棉签轻轻擦去上室未穿透的细胞，甲醛固定下室侧细胞，结晶紫染色后，显微镜下计数穿透细胞数。

（二）Millicell小室操作（以类器官气液界面培养为例）

1. 实验前准备：  

￮ 选择悬挂式小室（适配6孔板），膜孔径3.0μm，用PBS冲洗2次，晾干备用。  

￮ 类器官预处理：将制备好的类器官（如肠道类器官）用胰酶轻微消化，制成单细胞悬液（密度5×10³ cells/cm²）。  

2. 细胞铺板与环境构建：  

￮ 小室膜上表面接种类器官细胞，加入少量培养基（仅覆盖膜表面，避免淹没细胞）。  

￮ 培养板孔内加入足量培养基（液面距小室膜下表面1-2mm），构建“上室气、下室液”的气液界面。  

3. 培养与分化：  

￮ 前2天用完全培养基培养（促进细胞贴壁），第3天更换分化培养基，每2天换液1次（仅更换下室培养基，避免触碰上室细胞）。  

￮ 培养7-14天后，通过相差显微镜观察类器官分化形态（如肠道绒毛结构）。

三、常见问题解答

1. 细细胞共培养小室孔径选错了会有什么影响？  

￮ 孔径过小（如用0.4μm做肿瘤侵袭）：细胞无法穿透膜，导致实验无结果；  

￮ 孔径过大（如用8.0μm做间接共培养）：细胞会迁移到对侧，打乱分组，污染样本。  

￮ 解决方案：实验前先查目标细胞直径（如肿瘤细胞约10-20μm，需8.0μm孔径；免疫细胞约5-10μm，0.4μm即可阻断）。

2. 细胞密度怎么控制才合适？  

￮ 贴壁细胞：推荐10³ cells/cm²（如6孔板Transwell小室，每孔接种5×10⁴-1×10⁵ cells）；  

￮ 悬浮细胞/类器官：密度可略高（1×10⁴ cells/cm²），但需避免过度拥挤导致营养不足。  

￮ 关键：预实验测试3个密度（低、中、高），选择24小时后覆盖率50%-70%的密度。

3.如何判断细细胞共培养小室的膜是否破损？  

￮ 方法1：未铺细胞前，向小室加少量亚甲蓝溶液，观察下室培养基是否变蓝（变蓝则膜破损，需更换小室）；  

￮ 方法2：培养后若发现下室出现大量非目标细胞，大概率是膜破损导致细胞迁移。

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