活细胞成像是使用从几毫秒到几小时的延时成像来研究活细胞中的动态生理过程。细胞成像将多个快照转换为影像，这与在某个时间点检查细胞活动的固定细胞成像形成对比。活细胞成像主要用于研究动力学事件，包括酶活性、信号转导、蛋白质运输和膜回收过程。成功的成像依赖于是否达到活细胞成像的适宜条件。

对培养细胞进行活细胞成像需要以下条件：

一、培养基选择

可以使用培养的细胞系（如 HEK 细胞和 HeLa 细胞）和原代细胞培养物（如皮肤细胞）进行活细胞成像。您甚至可以使用合适的 扫描成像显微镜对活体小鼠或大鼠体内的整个大脑进行 成像 。

细胞生长培养基溶液或基于盐水的培养基配方，如 DMEM、RPMI 和 Leibovitz L-15等由于不含影响背景荧光的成分被广泛用于活细胞成像实验。另一方面，盐水配方有助于缓冲且具有一定的光学透明度，但不能用于需要高代谢活性的长期研究。活细胞成像的适宜 条件：四二、活细胞成像的 关键因素

1.酸碱度

pH 值对于细胞系有效生长至关重要。例如，大多数细胞系在 pH 7.2-7.4 时繁殖最好，成纤维细胞在 pH 7.7 时繁殖最好，转化细胞系在 pH 7 左右时表现出色。为了跟踪细胞生长阶段培养基 pH 值的变化，使用酚红在某些情况下作为 pH 值的指示剂，在 pH 7.4 时为红色。酚红在酸性溶液中变成橙色（pH 7）和黄色（ pH 6.5 ），在碱性溶液中变成粉红色（ pH 7.6）和紫色（pH 7.8）。然而，活细胞成像中的常见培养基配方避免使用酚红，因为酚红的光吸收消光系数高，这可能会导致背景噪声。

2.缓冲系统

pH 缓冲系统主要包含NAHCO3和二氧化碳。在实验中，合成的 生物缓冲液可作为短期研究中的缓冲介质。比如：HEPES 。当细胞外溶液不能用 HEPES 缓冲时， CO 2被输送到系统中，当与细胞外溶液接触时，系统会分解成碳酸氢盐。这就是为什么显微镜上的活细胞成像通常需要专门为调节气体设计的孵化室。通常，浓度为 10-20mM 的 HEPES 缓冲液可以在没有 CO 2 气体的情况下控制 pH 值，并提供碳酸氢钠以实现适宜生长。

3.氧气浓度

细胞系的氧气需求变化很大。哺乳动物细胞需要氧气进行体内呼吸，但在体外作为原代 细胞生长或永生化后，氧气通常可以替代无氧糖酵解。但大多数活细胞成像实验不需要严格的氧气调节。所以使用氧气调节策略 通常被用于应对 活性氧反应可能发生的光损伤。该策略可能涉及氧气消耗系统（例如氧化酶）或抗氧化剂（例如维生素 C）以限制自由基损伤。然而，减少的氧气 在某些情况下，紧张可能会导致缺氧应激，这对细胞可能是危险的。

4.渗透压

大多数细胞系在 260 和 320 mosM 之间的广泛渗透压值范围内有效生长。通过添加 HEPES 改变体质时，监测培养基的渗透压很重要。大多数成像室容纳的小体积介质在介质温度高时会由于蒸发而发生渗透压变化。在大多数情况下，显微镜有一个 CO 2控制的孵化室，用于在 37 o C 下处理哺乳动物细胞。低渗培养基可以在培养皿中常规更换以补偿蒸发。也可以通过将介质密封在带有油的开放室中或通过控制湿度来最大程度地减少蒸发。

表 1.哺乳动物细胞活体成像的环境控制概述。

三、获得适宜活细胞成像条件的技巧

在短期研究中使用大量培养基可以避免由于蒸发而导致的渗透压和 氧气的偏差。对于长期研究，可以应用加热单元、加湿孵化室和基于碳酸氢盐的缓冲系统的组合来控制环境参数。

通常先进的宽场和共聚焦显微镜技术用于更好地解释活细胞成像实验中的结果。例如，在相差和微分干涉对比 (DIC) 显微镜下观察细胞生长和发育，但有时更喜欢在立体显微镜下观察发育胚胎研究。另一方面，荧光技术用于标记特定的细胞化合物，使它们在共聚焦显微镜下更好地观察。

然而，活细胞成像系统仅限于某些适宜条件，以确保细胞保持健康状态。总之，活细胞成像既需要关注实验过程中的细胞功能，又需要应用特定的实验方法。因此，在这些实验中回顾培养基、环境控制、pH 值和成像技术的应用非常重要，在这些实验中，微 小的调整都可能会改变细胞成像的效果。

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