蛋白免疫印迹技术（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。蛋白免疫 印迹技术主要用于检测或分析蛋白，例如用酵母表达某种目的蛋白，把基因克隆到宿主后，要检测目的蛋白的表达就可以用western blot。

蛋白质印迹技术背景

20 世纪 70 年代，Southern 教授发明了检测 DNA 的方法，命名为 Southern blot。之后，随着技术的发展，另一位科学家发明了检测 RNA 的方法，由于其与 DNA 检测相对应，被称为 Northern 印迹技术。在这些技术的基础上，蛋白免疫印迹技术 Western blot 逐渐发展起来。它借鉴了前两者的原理，用于检测和分析蛋白质，成为分子生物学等领域的重要工具。

一、蛋白电泳：目前最常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳），在这一步蛋白质会根据分子量大小分开，分子量小的会在胶的底部，分子量大的会在胶的顶部。

SDS也就是十二烷基硫酸钠是带负点的，它可以消除蛋白质的电荷差异，只保留大小差异，使其都带上负电，从而能在电场的作用下迁移。

二、转膜：此步骤主要是将蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的是硝酸纤维素膜和PVDF（聚偏氟乙烯），膜具有与蛋白质高度亲和的能力，也就是说更容易与蛋白结合。

为什么要将蛋白从胶上转移到膜上进行检测呢？因为蛋白电泳时位于胶的内部，而转移到膜上位于膜的表面，更容易与之后的抗体结合。

那么如何将蛋白质从胶转移到膜上呢？

    之前提到过蛋白质在电泳作用下已经带上了负电，那么我们只需要在胶和膜的外面外加一个电场，蛋白就会向膜上移动了。具体操作需要先做一个“三明治”，海绵垫、滤纸、膜、胶、滤纸、海绵垫（见图），滤纸的作用是维持稳定的流动，而海绵垫则对整个系统起到稳定的作用。

 然后将膜放在靠近正极的一侧后我们将它放入转膜槽进行转膜，过程中我们会加入甲醇，由于甲醇可以使蛋白质与SDS分离，加入甲醇可以使蛋白质更好的结合膜。

三、封闭：前面提到膜与蛋白质具有高度亲和的能力，所以我们必须封闭空白着的结合位点，防止之后加的抗体与膜直接结合，也称阻止非特异性结合。通常我们会用脱脂牛奶或者牛血清蛋白（BSA）作为缓冲液。

四：加抗体：一般先加第一抗体，一抗可以和我们的蛋白质特异性结合，之后需要洗几遍膜，将未结合的一抗洗掉，下一步加入第二抗体检测，二抗是被标记了的抗体，可以与一抗特异性结合，一个一抗可以和两个甚至更多的二抗结合，放大检测信号，同样二抗孵育完也要把未结合的二抗洗去。

五、检测：二抗通常会用碱性磷酸化酶或辣根过氧化物酶（HRP）标记，最后当我们加入底物时，HRP就会引起化学发光，从而使我们能够看到目的条带。而后用胶片曝光就得到了最终结果。

蛋白免疫印迹技术注意事项

 ▪ 转膜时滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

 ▪ 转膜时间一般为1.5 小时，需要根据分子量大小调整转膜时间和电流大小。

 ▪ 为避免出现信号低的情况，可以选用高灵敏度的发光液，如ECL发光液等。  

Western blot蛋白免疫印迹技术不仅是大部分实验的重要基础，更是医学领域中常见的实验技术。因其操作原理与众多实验具有相似性，所以扎实掌握这一技术，对其他实验技术的学习也大有裨益。更多电泳仪，电泳槽，化学发光成像仪，凝胶成像仪等Western blot实验室仪器，实验耗材以及生物试剂可以进入苏州阿尔法生物网站进行了解， 0512-62956104或18934597460.

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