人原代细胞是直接从组织中分离出来的细胞，包括外周血、脐带血和骨髓。这些细胞因其在生物过程、疾病进展和药物开发研究以及包括基于体外细胞的分析或创建异种移植或人源化小鼠模型在内的应用中的重要性而日益受到认可。

如果不需要立即使用，新鲜的原代细胞通常会低温保存（即冷冻），以便在液氮中长期储存。处理新鲜样品资源有限的研究人员也可以 购买冷冻的即用型原代细胞，包括单核细胞 (MNC)、纯化的免疫细胞或造血干细胞。解冻冷冻细胞时，正确的技术和处理可确保细胞在下游应用中的活力、恢复和功能。如何解冻冷冻的原代细胞?
一、实验前准备：

1. 添加了 10% 胎牛血清 (FBS)的 改良培养基（IMDM）

2. DMEM 含 4500 mg/L D-葡萄糖，添加了 10% FBS

3. RPMI 1640 培养基，添加了 10% FBS

4. 含 2% FBS 的磷酸盐缓冲盐水（例如含 2% 胎牛血清的磷酸盐缓冲盐）

5. 2 mL 血清移液管（例如nest 血清移液器，2 mL）

6. 25 mL 血清移液管（例如nest 血清移液管，25 mL）

7. 50 mL 锥形管（例如 nest离心管，50 mL）

8. DNase I 溶液 (1 mg/mL)（天根试剂）

9. 细胞计数仪（博大博聚）

10. 台盼蓝（索莱宝）

11. 移液器（瑞宁移液枪，rainin电动助吸器）

12. 移液器吸头（瑞宁，耐思）

13. 人原代细胞

注意事项：

 在 37°C 水浴锅中加热培养基。如果解冻细胞用于下游细胞分离，可以使用含有 2% FBS 的 PBS。

 从储存中取出冷冻细胞时，重要的是尽量减少暴露于室温 (15 - 25°C)。如果不直接进行解冻，请将细胞置于干冰或液氮容器中。

二、解冻细胞

注意：建议一次只解冻一个冷冻细胞小瓶，以防止在较高温度下长时间暴露于 DMSO。

2.可 用 70% 乙醇或异丙醇擦拭细胞瓶的外部。

 3.在生物安全柜中，将盖子拧四分之一圈以释放内部压力，然后重新拧紧。

 轻轻旋转小瓶，在 37°C 水浴中快速解冻细胞。当仍有少量冰时，取出小瓶。这大约需要 1 - 2 分钟。

三、细胞洗涤和计数

注意：重要的是在以下步骤中快速工作以确保高细胞活力和恢复。

 用 70% 乙醇或异丙醇再次擦拭小瓶的外部。

 在生物安全柜中，使用 2 mL 血清移液器测量细胞悬浮液的总体积。该值在步骤 13 中用于计算提供的单元格总数。将细胞放回小瓶中以混合悬浮液。

 取出 20 μL 等分的细胞进行计数。如果使用台盼蓝评估活力，对于 ≥ 1 x 10 6 个细胞，至少添加 20 µL 培养基并记录添加的培养基体积。对于 < 1 x 10 6 个细胞，直接用 20 µL 台盼蓝稀释。将稀释的等分试样放在一边，直到第 13 步。

重要提示：必须对解冻后（洗涤前）立即收集的等分试样进行活细胞计数。这将确认提供的细胞数量，并跟踪洗涤过程中潜在的细胞损失。在洗涤步骤中，预计细胞损失高达 30%。

•  使用移液器将剩余的细胞悬浮液转移到 50 mL 锥形管中。
•  用 1 mL 培养基冲洗小瓶并将其逐滴添加到细胞中，同时轻轻旋转 50 mL 管。
•  通过逐滴添加 15-20 mL 的介质进行清洗，同时轻轻旋转管子。
• 在室温 (15 - 25°C) 下 以 300 x g 离心细胞悬液10 分钟。
•  如果使用台盼蓝，对第 8 步稀释的等分试样进行细胞计数。
•  用移液器小心地去除上清液，留下少量培养基以确保细胞沉淀不受干扰。轻轻弹动试管重悬细胞沉淀。
•  如果细胞开始结块，每毫升细胞悬浮液加入 100 µg DNase I 溶液，并在室温下孵育 15 分钟。

注意：如果细胞将用于 DNA 或 RNA 提取，请勿添加 DNase I 溶液。

•  轻轻地将 15-20 mL 的介质添加到管中。
• 在室温下 以 300 x g 离心细胞悬液10 分钟。
•  用移液器小心去除上清液，留下少量培养基以确保细胞沉淀不受干扰。轻轻弹动试管重悬细胞沉淀。

解冻后的 细胞即可用于下游应用。

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