降低CHO细胞培养中的乳酸水平的方法

    乳酸是CHO细胞补料分批培养的主要副产品之一。在 pH 控制的生物反应器中， 由于添加碱以控制细胞培养基的 pH值，高水平乳酸的积累伴随着高渗透压，可能导致制造细胞生长缓慢，甚至大量凋亡，同时产生抗体蛋白的产量也降低不少。而 乳酸脱氢酶 (LDH) 是一种催化底物丙酮酸转化为乳酸的酶，包括丙酮酸浓度在内的许多因素都会调节 LDH 活性。

乳酸脱氢酶对代谢产物的影响

     在一项研究中，科学家们曾尝试敲低乳酸脱氢酶 A (LDHa) 和 PDHK 的基因表达，以研究对乳酸代谢和蛋白质生产的影响。他们发现，使用携带 LDHa 和 PDHK 的小抑制性 RNA (siRNA) 的单个靶向载体，可以成功地同时下调 LDHa 和 PDHK。此外，他们使用 siRNA 介导的 LDHa/PDHKs 敲低克隆的分批补料摇瓶评估数据显示，在表达治疗性单克隆抗体的 CHO细胞中下调 LDHa 和 PDHKs会减少乳酸产量，增加比生产率和体积 抗体产量分别减少约 90%、75% 和 68%，对细胞生长没有明显影响。从在生物反应器中进行的评估中也观察到 siRNA 克隆平均较低乳酸水平和较高抗体生产率的类似趋势。

降低CHO细胞培养中的乳酸水平的方法

     生物制药蛋白质产品市场正在快速增长，在2010年时已经达到 700 亿美元。由于对功能性蛋白质的需求增加，需要开发技术以实现更高的生产率。为实现这一目标，已经在 CHO细胞中探索了包括宿主细胞工程在内的不同方法。CHO 细胞广泛用于生产治疗性蛋白质，包括在具有受控 pH 值的生物反应器中使用分批补料工艺生产重组单克隆抗体。乳酸是补料分批培养过程中积累的主要副产物之一，已表明高乳酸水平会抑制细胞生长和蛋白质生产。    生物反应器中葡萄糖乳酸指标分析一般使用EKF Biosen C-Line 乳酸分析仪来在线测定，培养过程中多数选用通过调节培养基中的碱度的方式来维持适宜细胞生长的PH环境。但是，乳酸分泌和向培养基中增加碱这两者都会导致渗透压增加，从而抑制细胞生长并导致抗体生产率降低。因此，降低乳酸水平对于开发稳健且高效的抗体生产过程是可取的。乳酸分泌和向培养基中增加碱以维持 pH 值会导致渗透压增加，从而抑制细胞生长并导致抗体生产率降低。因此，降低乳酸水平对于开发稳健且高效的抗体生产过程是可取的。乳酸分泌和向培养基中增加碱以维持 pH 值会导致渗透压增加，从而抑制细胞生长并导致抗体生产率降低。因此，降低乳酸水平对于开发稳健且高效的抗体生产过程是可取的。

     有许多因素会影响哺乳动物细胞培养物中的乳酸生成，包括丙酮酸的细胞内浓度。丙酮酸是 LDH 和 PDH 的底物，是决定消耗的碳源是通过糖酵解氧化后作为乳酸排出还是在 TCA 循环中进一步代谢的关键分支点。LDH 在催化丙酮酸和乳酸转化的同时也催化 NADH 和 NAD+ 的相互转化。在哺乳动物细胞中，LDH 以同源或异源四聚体的形式存在，主要由 LDHa 和 LDHb 基因编码的 A 和 B 亚基组成。在 CHO 细胞中，LDH 同种型已被证明是 A3B 和 A2B2 四聚体的中间体。

PDH 复合体活性的调节方法

     PDH 复合体是一种多酶单位，由三种催化酶 E1、E2 和 E3 组成。该复合物催化将丙酮酸转化为乙酰辅酶 A 的限速反应，乙酰辅酶 A 是三羧酸 (TCA) 循环的入口点。PDH 的活性受 PDHK 和丙酮酸脱氢酶磷酸酶 (PDHP) 的调节。PDHK 磷酸化 PDH 以抑制其酶活性，而 PDHP 去磷酸化并因此激活 PDH 酶活性。哺乳动物细胞中有四种 PDHK 同种型：PDHK1、PDHK2、PDHK 3 和 PDHK4。这些同种型中的每一种都具有不同的组织特异性分布。由于 LDHa 和 PDHKs 的表达都可以影响丙酮酸水平，并且之前已经表明敲低 LDHa 表达可以降低乳酸水平，他们假设如果他们同时减少 LDHa 和 PDHKs 的表达CHO 细胞中，更多的丙酮酸可能会转化为乙酰辅酶 A，从而增加这些细胞中 TCA 循环产生的能量。因此，LDHa 和 PDHK 的下调可能不仅会导致乳酸减少，还会导致 CHO 细胞中抗体产量增加。

       在这项研究中，他们证明了使用单个 siRNA 靶向载体可以同时降低 LDHa 和 PDHK1、2 和 3 的表达。当他们同时降低 LDHa 和 PDHK1、2 和 3 基因表达，使用EKF  Biosen C-Line 乳酸分析仪进行乳酸分析后，发现不仅乳酸水平大幅降低，抗体产量居然也增加了不少。

构建靶向 LDHa 和 PDHK1、2、 3 的载体

LDHa 的靶向序列是根据 Kim 和 Lee 的论文选择的，LDHa siRNA 序列是 CTCGATTCCGTTATCTGAT。为了设计 PDHK 的 siRNA 靶向序列，CHO PDHK1、2 和 3 的部分 cDNA 序列通过逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 克隆，引物位于 PDHK 的高度保守区域内，部分克隆的序列也用于 siRNA 序列设计。

构建靶向 PDHKs 和 LDHa 的 siRNA 载体

    在哺乳动物细胞中报道了四种 PDHK 基因 。为了确定是否所有四种 PDHK 基因都在 CHO细胞中表达，基于人和小鼠 PDHK 序列之间的保守区域设计了四组 RT-PCR 引物。 PCR 结果显示，即使在 CHO 细胞中可以检测到所有四种 PDHK mRNA，但 PDHK4 mRNA 水平最低，并且远低于 DHFR 缺陷型 CHO 细胞中的其他 3 种 PDHK（数据未显示）。

    实验已经证明，单独降低 LDHa 基因表达能够减少乳酸的产生。然而，尽管乳酸水平降低了 45-79%，但 Qp 和产物滴度没有明显改善，这表明在 CHO 细胞中单独敲低 LDHa 不足以有效提高 Qp 和产物产量。

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