细菌基因组DNA提取试剂盒 DP302采用离心吸附柱和缓冲液系统，既适用于革兰氏阴性菌基因组DNA的提取，也可适用于革兰氏阳性菌基因组DNA的提取。

本试剂盒也可用于食品致病菌(微生物) 基因组提取，如：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、出血性大肠杆菌O157：H7、单增李斯特、沙门氏菌、阪崎肠肝菌等。可从1-5 ml细菌培养液中，快速提取纯化10-40 μg 纯净的基因组DNA，所得基因组DNA可直接用作PCR 模板、酶切、杂交等分子生物学实验。

■ 简单快速：革兰氏阴性菌在1小时内可获得高质量的基因组DNA。

■ 质量好：DNA可直接用于PCR、酶切、杂交等分子生物学实验。

溶菌酶( 革兰氏阳性菌)、溶菌酶缓冲液(20 mM Tris, pH8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2%Triton-100 )

1．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。

2．若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并摇匀后使用。

操作步骤使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入CH3CH2OH，加入体积请参照瓶上的标签。

1. 取细菌培养液1-5 ml，10,000 rpm(~11,500×g)离心1 min，尽量吸净上清。

注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第2步骤，加入溶菌酶溶液进行破壁处理。

具体方法为：加入110 µl缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton），和70 µl溶菌酶溶液（50 mg/ml，客户自备，目录号：RT401），37 ℃处理30 min以上。如果需要去除RNA，可加入4 μl RNase A（100 mg/ml）溶液（客户自备，目录号：RT405-12），振荡15 sec，室温放置5 min。

4. 加入220 μl缓冲液GB，振荡15 sec，70 ℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。

如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

5. 加220 μl CH3CH2OH，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）， 12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7. 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8. 向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

10. 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。

将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，以晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

11. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，将溶液收集到离心管中。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有较大影响。

若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

为增加基因组 DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min。

得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 DNA应在OD260处有吸收峰，OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。 OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。