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  • 葡聚糖凝胶介质

葡聚糖凝胶过滤介质 Smartdex G-10

Smartdex G-10过滤介质是以葡聚糖凝胶为过滤层析(gel filtration chromatography)介质,其工作原理类似亲和层析主要是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用,进行蛋白纯化和蛋白分离。
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Smartdex G-10系列介质是一类以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)介质,其工作原理主要是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

  葡聚糖凝胶是一种具有三维网状结构的高分子化合物,它是由葡聚糖加入交联剂通过醚键互相交联聚合而成的,交联度越大,网孔结构就越紧密,吸水后的体积膨胀就越小,能允许进入凝胶内部的分子的分子量也就越小,反之亦然。层析时,大于凝胶孔径的大分子,被阻于凝胶相外,沿着凝胶颗粒之间的间隙走,下移速度最快,故最先洗脱下来,中分子物质部份进入凝胶内部,洗脱速度为其次,而小分子物质因全部进入凝胶,受到阻力大,故最后被洗脱下来,如此物质得到分离。

   型号G表明每克于凝胶吸水量的多少,例如G-10表明每克干凝胶吸水1.0克。这表征了凝胶所能膨胀的倍数,亦间接表征了凝胶孔径的大小。


表1.Smartdex G-10产品性能

项目

性能

颗粒大小 (干)

100-200目

分离范围 (球蛋白)

<7×102 Da

溶胀体积(ml湿胶/g干粉)

2.0-3.0

pH稳定性

pH 2-13


2.装柱说明



2.1凝胶的预处理


Smartdex G-10 为于粉,初次使用前必须进行预处理。溶胀过程中严禁使用磁力搅拌,以免使微球破碎。

加入足够的水或缓冲液进行溶胀,室温3h 以上或水浴 90℃、1h。如果室温溶胀则需要进行真空脱气,然后将溶胀好的微球按照3∶1(v/v)加入水或缓冲液搅拌使其形成均匀的75%胶悬液。如果是重复使用的可以将 20%乙醇倾去,加水或缓冲液搅拌均匀成75%的胶悬液。

2.2 Smartdex G-10 的装填

2.2.1重力柱的装填

1)取合适规格的重力层析柱,装入下垫片,加入适量纯水润洗柱管和垫片,关闭下出口。

2)将溶胀好的介质混合均匀,用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占悬液的75%),打开下出口流干保护液。3)加入适量纯水冲洗介质,待柱管中液体重力流干后,关闭下出口。4)装入润洗后的上垫片,确保垫片与填料之前没有空隙,且保持水平。

5)装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡,暂不使用时则加入保护液,4-30℃保存。

2.2.2 层析柱的装填

装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积,根据所需装柱高度计算所需介质体积,公式如下∶

V=1.15mh

V∶所需介质体积 ml 1.15∶压缩系数r∶柱管半径 cm h∶装填高度 cm

注意∶介质实际体积占所取悬液总体积的 75%。

1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2cm 的去离子水。2)将填料悬浮起来,小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。


3)如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。4)打开层析柱底部出口,开启泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速,可以用你所使用泵的最大流速,这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意∶在随后的色谱程序中,不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后,在最后的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。5)关闭泵,关闭层析柱出口。

6)如果使用储液器,去除储液器,将分配器置于层析柱中。

7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。


3.纯化流程


3.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm 或0.45 um 滤膜过滤。

平衡液为蛋白纯化后,用干保护蛋白的溶液(例如;PBS等),根据客户需求自行选择。

3.2 样品准备

样品在上样前建议离心或用0.22 μm 或0.45 μm 滤膜过滤,减少杂质,防止堵塞柱子。

3.3 样品纯化1平衡

上样之前,用平衡液至少平衡 5-10个柱体积,或直到基线稳定。含去垢剂的溶液可能需要平衡更长时间。2)上样和洗脱

推荐上样体积为柱体积的 10%以内。脱盐时最大样品量可至 30%柱体积。使用重力柱纯化时。待样品进入填料后,继续加入平衡液进行洗

脱,使用预装层析柱纯化时,可以通过上样管或样品环来上样。分管收集洗脱液,样品进入填料开始,按昭固定体积(例如 1ml/管)收集

样品,检测每管蛋白浓度和盐浓度,计算回收率和脱盐效率。预装层析柱纯化流速最高不能超过装柱流速的 70%。

凝胶过滤是一种非吸附性色谱技术,所有的样品物质都应在一个柱体积之内洗脱出来。完成一次操作后,如仍用同一种缓冲液,色谱柱不需要再平衡。3)再生

再生通常用水冲洗2 倍柱体积,然后用缓冲液冲洗2-3倍柱体积,如果不立刻使用,则用20%乙醇平衡后,4-30℃C保存。对不同的样品,建议大约5次循环后,采用完整的在位清洗(CIP)。

4.清洗及保存

在位清洗∶为除去变性蛋白或脂肪,有时需要对脱盐柱进行原位清洗。常用的清洗液为0.1-0.2 M NaOH 或非离子型去垢剂。

1)加入一倍的柱体积0.1-0.2 M NaOH,依靠重力或者低流速清洗介质。

2)用足够量的去离子水,冲洗介质,直至 pH 值至中性。

3)用至少三倍柱体积 20%乙醇溶液冲洗介质,然后做好色谱柱的密封,置于2-8℃保存。

注∶不建议介质多次重复再生和使用。

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