苏州阿尔法生物实验器材有限公司

13年专注生物实验室仪器设备&耗材综合供应

0512-6295610418934597460

阿尔法构建全服务链体系 尊享高于原厂服务的价值
利用脂质体转染试剂进行293T细胞转染实验步骤
作者: 阿尔法生物 编辑: 苏州阿尔法 来源: 苏州阿尔法生物 发布日期: 2022.06.22
信息摘要:
 LipoGene2000、Lipofectamine 3000脂质体转染试剂是一种常用的阳离子脂质体转染试剂,它可以 有效地将质粒或 si…

 LipoGene2000、Lipofectamine 3000脂质体转染试剂是一种常用的阳离子脂质体转染试剂,它可以 有效地将质粒或 siRNA 以及核酸-蛋白质复合物转染到培养的贴壁和悬浮细胞系中。研究人员经常使用 LipoGene/ Lipofectamine 系列转染试剂进行基于 siRNA 和 shRNA 的基因敲除实验以及基因表达研究。293T细胞转染实验步骤如下:

细胞转染实验

1、细胞培养:以293T细胞转染前一天(20-24小时)~0.4×10 6 个细胞(具体细胞数取决于细胞大小和细胞生长速度),接种到六孔板中,使其达到70-90%次日转染时汇合。

2. 在接下来的转染步骤之前更换新鲜的细胞培养基。培养基的体积约为 2 ml。

3. 轻轻混合 Lip脂质体转染试剂。

4. 取无菌离心管,在 250 μl DMEM 溶液中加入 4 μg 质粒,用移液器轻轻混匀。

这里需要注意两点:

a.抗生素、谷氨酰胺等对 LipoGene 转染或Lipofectamine没有影响。如果 Lip转染试剂表现出对靶细胞毒性作用 ,建议从转染系统中去除抗生素。

b.如果有必要,DMEM 可以更换为其他培养基,如 1640、 MEM、F12 等,这对 Lip转染试剂 的转染效率没有影响。质粒的量可在0.1μg ~4μg范围内适当调整,Lip的量通常为4~ 8μl(质粒体积/LipoGene体积=1:1~1:2 )。由于细胞类型、培养条件、转染参数等会极大地影响转染效率,因此需要在推荐范围内优化质粒体积/Lip转染试剂体积。对于其他培养板或培养容器,各试剂用量可参照转染试剂相关说明表进行换算。

5. 取另一个无菌离心管,在 250 μl DMEM 溶液中加入 6 μl LipoGene,用移液管轻轻混匀,室温孵育 5 分钟。

6. 用移液管将步骤 4 中的 DNA 溶液与步骤 5 中的 LipoGene 溶液轻轻混合。这个过程中需要注意不要涡旋或离心。

7. 在室温下孵育 LipoGene-DNA 混合物 20 分钟。可能会出现絮状沉淀,属于正常现象,不会影响转染效率。

8. 将 500 μl LipoGene-DNA 混合物加入六孔板的一个孔中,无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,然后轻轻摇晃并混合成“8”字形。

9. 注意:对于贴壁细胞,如上所述,只需将 LipoGene-DNA 复合物添加到细胞中并孵育 6 小时,然后再更换溶液。如果转染悬浮或半悬浮细胞,建议使用平角离心法,在细胞培养皿中加入适量的 LipoGene-DNA复合物后(步骤8),密封密封膜,放入平角离心机,低速 (200 g) 离心 1.5 小时,然后放入培养箱中 6 小时,然后更换培养基。

10. 培养6-12小时后,用完全培养基更换培养基,继续培养。

转染试剂参数

  这里需要注意的是:当与细胞一起孵育 6 小时时,Lip试剂转染后的混合物通常足以产生高转染效率。大多数细胞与 LipGene型转染试剂一起培养长达 72 小时,没有明显的细胞毒性。但是,转染后6小时更换新鲜培养基可以提高一些生长较快的细胞的转染效率。对于一些容易转染的细胞,如HEK-293T细胞,是否更换转染液主要 取决于细胞的生长状态,细胞生长快转染效率就高。

11、细胞转染后的操作:

1)基因表达,24-40小时后可检测转染效率。可以用荧光显微镜观察 GFP 或其他荧光基因的表达。

2)构建稳定细胞株,转染后24小时可加入合适的筛选药物如G418或嘌呤霉素筛选稳定细胞株

293t细胞转染实验步骤 中的注意事项:

1. 使用高的纯度 DNA (A260/A280=1.8) 有助于获得较高的转染效率。对于质粒,建议使用 Qiagen 或天根的质粒提取试剂盒进行高质量且无内毒素的提取。

2、细胞的生长状态会对细胞的转染效率造成较大影响,所以转染前细胞要处于良好的生长状态。

3.转染试剂盒中一般是不带DMEM培养基,需要自行配备。其他培养基如 1640、MEM、α-MEM 、F12、DMEM/F12 和 M199 也是可以 可用于转染实验的。

4. LipoGene 或Lipofectamine脂质体转染试剂不能涡旋或离心。当该试剂放置较长时间时,只需轻轻摇晃并混合即可。

5. 试剂长时间暴露在空气中,也有可能会降低转染效率。

6、出于健康和安全的考虑,需要在符合洁净度要求的细胞培养室进行转染,并穿戴实验室外套和一次性手套、口罩和无菌帽。

lip2000

        苏州阿尔法生物做为上海楚怡厂家的深度合作商,不仅提供细胞生物反应器、微生物发酵罐等细胞规模化生产设备还可根据客户要求的尺寸进行定制化操作,可用于 HEK293细胞 的培养,悬浮细胞培养、贴壁细胞培养、微载体培养、微生物培养的生物反应器 ,实现了厂商直供,一罐多用,满足不同的用户需求。并提供、生物反应器安装服务技术支持、操作指导以及脂质体细胞转染试剂、电转仪等。以上 293t细胞转染实验步骤仅供参考,如需了解更多293t细胞转染、细胞转染试剂相关问题,请 0512-62956104或  18934597460 进行咨询。

文章标签:脂质体 试剂 细胞转染 细胞培养 



更多产品内容请咨询:0512-62956104  或  18934597460


苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年,位于苏州园区生物纳米园(Biobay)A5幢301室。公司管理团队专注于科学仪器行业十三年,拥有专业的技术团队与完善的售后服务体系,目前已为300余家实验室提供优质产品和服务,涵盖各大高校、医疗机构、检测中心、科研机构、制药企业等13个群体。提供的实验室仪器主要包括振荡培养箱,PCR仪,移液器,生物反应器,发酵罐,移液器,超低温冰箱,医用冰箱,液氮罐,高压灭菌器,超纯水机,天平,离心机,离心浓缩仪,生物安全柜等。厂商企业授权包括知楚仪器、朗基、中科美菱,梅特勒,乐枫,搏旅、NEST、天根、奥盛在内的80个余厂家。

  在提供产品的同时也为您提供生物实验室常用的耗材试剂,以及实验室整体搬迁、第三方检测、计量与校准,二手仪器调剂等服务。完整的实验室一站式体验使您的选择更加方便、快捷、灵活。 

  阿尔法性价比:一级代理;一手货源;进口品质,国产价格; 

  阿尔法交货期:自有仓库,标准品有库存,常规试剂耗材备有现货;  

 阿尔法服务项目:实验室现场规划,提供选型建议,合理化配置; 

  阿尔法售后服务:及时响应,2小时给出解决方案,12小时内响应服务。

  阿尔法增值服务:免费供样机体验,免费提供样品试用,免费安装指导,免费技术指导  

  阿尔法质保期:终身质保,免费更换配件

四张拼图

【相关推荐】

阿尔法推荐资讯

我们正青春

我们正青春

时值青春我们有什么资格不努力?风华正茂我们有什么理由不奋起?!
2021-09-30
瑞宁移液器吸头促销—开学季大礼包

瑞宁移液器吸头促销—开学季大礼包

瑞宁移液器开学季促销:买三送一,买十送一。
2021-08-31
细胞培养

细胞培养前景怎么样-细胞培养的机遇与挑战有哪些?

在制药行业,细胞培养已成为抗体生产的重要组成部分。细胞培养技术已被用于生产轮状病毒、脊髓灰质炎、天花、肝炎、风疹和水痘等相关抗体。基于细胞的流感抗体也已获准在美国和许多欧洲国家使用。那么细胞培养前景怎么样?
2022-03-08

咨询热线

0512-62956104