（一）材料

含 pBS 的 E. coli DH5α 或 JM 系列菌株，1.5ml 塑料离心管 (又称 eppendorf 管)，离心管架。

（二）设备

微量取液器 (20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器 (灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

（三）试剂

1. LB 液体培养基 (Luria-Bertani)：称取蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物 (Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于 800ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5，加去离子水至总体积 1 升，高压下蒸气灭菌 20 分钟。

2. LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g 琼脂粉，高压灭菌。

3. 氨苄青霉素 (Ampicillin, Amp) 母液：配成 50mg/ml 水溶液，-20℃保存备用。

4. 溶菌酶溶液：用 10mmol/L Tris・Cl (pH8.0) 溶液配制成 10mg/ml，并分装成小份 (如 1.5ml) 保存于 - 20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。

5. 3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml 水中溶解 40.81g NaAc・3H2O，用冰醋酸调 pH 至 5.2，加水定容至 100ml，分装后高压灭菌，储存于 4℃冰箱。

6. 溶液 Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液 Ⅰ 可成批配制，每瓶 100ml，高压灭菌 15 分钟，储存于 4℃冰箱。

7. 溶液 Ⅱ：0.2mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释)，1％SDS。

8. 溶液 Ⅲ：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至 100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+ 3mol/L，Acˉ 5mol/L。

9. RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris・Cl (pH7.5)，15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100℃加热 15 分钟，使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于 - 20℃。

10. 饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联，应在 160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入 0.1％的 8 - 羟基喹啉 (作为抗氧化剂)，并用等体积的 0.5mol/L Tris・Cl (pH8.0) 和 0.1mol/L Tris・Cl (pH8.0) 缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上，因为酸性条件下 DNA 会分配于有机相。

11. 氯仿：按氯仿：异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积 / 体积＝1:1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚 / 氯仿 (1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

12. TE 缓冲液：10mmo/L Tris・Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于 4℃冰箱中。

13. STET：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)，5% Triton X-100。

14. STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。

15. 电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至 1000ml。（2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。

二、操作步骤

（一）细菌的培养和收集

将含有质粒 pBS 的 DH5α 菌种接种在 LB 固体培养基 (含 50μg/ml Amp) 中，37℃培养 12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基 (含 50μg/ml Amp) 中，37℃振荡培养约 12 小时至对数生长后期。

（二）质粒 DNA 少量快速提取

质粒 DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒 DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得 DNA 有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

1. 煮沸法

1. 将 1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中，4℃下 12000ｇ离心 30 秒。

2. 弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3. 将菌体沉淀悬浮于 120ml STET 溶液中，涡旋混匀。

4. 加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液 (10mg/ml)，涡旋振荡 3 秒钟。

5. 将 eppendorf 管放入沸水浴中，50 秒后立即取出。

6. 用微量离心机 4℃下 12000g 离心 10 分钟。

7. 用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片。

8. 取 20ml 进行电泳检查。

[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的质粒 DNA 中会含有 RNA，但 RNA 并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化、亚克隆及连接反应等。

2. 碱法

1. 取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中，4℃下 12000g 离心 30 秒。

2. 弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。

3. 菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液 Ⅰ 中 (需剧烈振荡)，室温下放置 5-10 分钟。

4. 加入新配制的溶液 Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管数次，以混匀内容物 (千万不要振荡)，冰浴 5 分钟。

5. 加入 150μl 预冷的溶液 Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 10 秒，使沉淀混匀，冰浴中 5-10 分钟，4℃下 12000g 离心 5-10 分钟。

6. 上清液移入干净 eppendorf 管中，加入等体积的酚 / 氯仿 (1:1)，振荡混匀，4℃下 12000g 离心 5 分钟。

7. 将水相移入干净 eppendorf 管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于 - 20℃冰箱中 20 分钟，然后 4℃下 12000g 离心 10 分钟。

8. 弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入 1ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下 12000g 离心 5-10 分钟。

9. 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥 10 分钟或室温干燥。

10. 将沉淀溶于 20μl TE 缓冲液 (pH8.0，含 20μg/ml RNaseA) 中，储于 - 20℃冰箱中。

[注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。

2. 提取质粒 DNA 过程中除去蛋白很重要，采用酚 / 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。

3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀。沉淀 DNA 也可用异丙醇 (一般使用等体积)，且沉淀全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

3. Wizard 少量 DNA 纯化系统

Promega 公司的 Wizard 少量 DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒 DNA，整个过程只需 15 分钟。提取的质粒可直接用于 DNA 测序、酶切分析和体外转录等。

该系统中所含试剂和柱子可以用于 50 次 1-3ml 质粒培养液的分离和纯化，试剂包括 10ml 细胞悬浮液，10ml 细胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂，50ml 柱洗液（使用前加 95% 乙醇至 120ml) 和 50 支 Wizard 微型柱。

1. 1-3ml 过夜培养细胞液 4℃下 12000g 离心 1-2 分钟。

2. 去除上清液，菌体细胞悬浮于 200μl 细胞悬浮液中，充分混合，并移入 eppendorf 管中。

3. 加 200μl 细胞裂解液，颠倒离心管数次，直到溶液变清亮。

4. 加 200μl 中和液，颠倒离心管数次。

5. 4℃下 12000g 离心 5 分钟，取上清液于新的 eppendorf 管中。

6. 加 1ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂，颠倒离心管数次以充分混匀。

7. 取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与 Wizard 微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。

8. 将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入 2ml 柱洗液，并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。

9. 取出微型柱置于 eppendorf 管中，离心 2 分钟以除去微型柱中的柱洗液。

10. 将微型柱放在一个新 eppendorf 管中，加 50μl TE (或水) 于微型柱中，静止 1 分钟后，4℃下 12000g 离心 20 秒。

11. 丢弃微型柱，将 eppendorf 管中的质粒 DNA 贮于 4℃或 - 20℃冰箱。

[注意] 树脂使用前应充分混匀，如有结晶，可将树脂用 25-37℃水浴处理 10 分钟。