实时荧光定量PCR（qPCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对初始模板进行定量分析的方法。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它的出现解决了传统PCR不能对初始模板定量分析的问题。荧光定量PCR具有准确性高、灵敏度高、特异性强等优点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

荧光定量PCR原理

在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化检测产物量的变化，末了得到一条荧光扩增曲线图，扩增曲线横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

荧光定量PCR常用术语

1. 基线：实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中（一般为3-15个循环）的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小。
2. 荧光阈值：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值默认是PCR 3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。
3. Ct值：Ct值指的是PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数。
4. 标准曲线：标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。对已知拷贝数的标准样品做系列稀释，对不同稀释度的标准样品进行荧光定量PCR并记录Ct值，根据Ct值及拷贝数的对数绘制得到标准曲线，标准曲线的纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代Ct值。
5. 实现对初始模板的定量
6. 利用实时荧光定量 PCR对样品的初始模板量进行定量分析，需要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再通过荧光定量PCR获得未知样品的Ct值，最后从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
7. 标准曲线绘制
8. 标准品的制备：设计特定引物，利用PCR对目的基因片段进行扩增，随后将目的基因片段克隆至载体中，测序验证是否为阳性重组质粒，最后收集阳性克隆质粒作为标准品。
9. 绘制标准曲线：测定质粒的浓度，依据公式计算出质粒的拷贝数。对质粒进行系列稀释，分别作为模板进行荧光定量PCR并记录Ct值。最后依据起始拷贝数的对数及Ct值绘制标准曲线，得到标准方程。当需要对起始模板进行定量时，只需要得到扩增曲线，读得Ct值，带入标准方程即可对起始模板定量。

荧光标记方法

荧光定量PCR荧光标记方法可分为荧光染料法和荧光探针法两类。

• 荧光染料：染料法是利用荧光染料可以嵌合到DNA双链内部的特性，来指示扩增产物的增加。
• 荧光探针：探针为一段寡核苷酸，可与DNA序列特异性结合，一个模板结合一个探针。探针5’端具有报告基团（R），可发光；3’端有荧光淬灭基团（Q），能吸收光。探针完整时R基团所发射的荧光能量被Q基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号。随着扩增的进行，探针会被聚合酶水解，报告基团发出的光没有被淬灭基团吸收，从而被仪器检测到。

荧光探针与染料法对比

探针法：特异性高、重复性好，但只适合一个特定的目标，探针价格较高。

染料法：对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA，使用方便，成本低，但容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性。

荧光定量PCR应用

  实时荧光PCR技术已广泛应用于医学及生命科学研究的各个领域中。在科研方面可定量分析各种基因的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态SNP测定及易位基因的检测；在医学方面可用于免疫组化分析、早期筛查、病原体检测、耐药性分析、肿瘤微小残留病变研究等。

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