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ELISpot技术需要哪些生物试剂和实验室耗材
作者: PBMC细胞 编辑: 免疫学检测 来源: 苏州阿尔法生物 发布日期: 2025.09.28
信息摘要:
ELISpot技术是近年来发展起来的一种新的免疫学检测方法,它是ELISA技术的延伸。
ELISpot技术是近年来发展起来的一种新的免疫学检测方法,它是ELISA技术的延 伸。目前该方法主要用于检测分泌 IFN-y 的细胞毒性T 细胞及其频率,初步筛选 CTL 识别的抗原肽表位。也可检测免疫细胞在单个细胞水平上分泌其他细胞因子的频率。
蛋白免疫法
( 一 )原理
该方法将识别细胞因子的抗体包被于特制酶标板的PVDF 膜或硝酸纤维素膜上,加 入待检活细胞孵育,细胞所分泌的相应细胞因子立即与膜上包被的抗体特异性结合,洗 涤去除细胞后,依次加入酶标二抗及沉淀性显色底物,即可在分泌相应细胞因子的细胞 所处局部的膜表面显现有色斑点。一个斑点表示一个分泌某种细胞因子的细胞,通过计 数,可以推算出这种细胞的频率。
酶联免疫斑点法原理

(二)试剂和器材
1.PVDF 膜酶标板 (Millipore)。
2. 合成抗原肽段。
3. 植物血凝素 (PHA)。
4.RPMI 1640-10%FCS培养液。
5.ELISpot 检测试剂盒。
6. 超净工作台。
7.CO₂ 培养箱。
8. 解剖显微镜。
(三)操作步骤 (以检测IFN-γ为例)
1. 包被:用pH 7.2 、0.15M PBS稀 释IFN-y 特异性单抗,使其终浓度达到5~10μg/ml, 加入 Millipore 的 PVDF 膜 板中,100μl/ 孔,4℃ 放置过夜。
2. 封闭:弃包被上清,用无 菌 PBS 洗6次,每孔加入200 μl RPMI 1640-10%FCS培养液,室温 下放置2 h。
3. 加细胞孵育:用无菌 PBS 洗板6次,每孔均加入20 μl 含有 肽段或植物血凝素的培养液。分离正常人外周血单个核细胞 (PBMC), 用培养液调整细胞浓度 为2×10⁵~1×10⁶/ml, 每孔加入 180μl, 放37℃,5% CO₂ 孵箱培 养6~24 h。
4. 加 生 物 素 化 二 抗 : 用 0.05%Tween20-PBS 洗板6次,每 孔加入100 μl 生物素化IFN-y 特 异性单抗,室温放置2~4h。
5. 加亲和素-酶复合物:用 0.05%Tween20-PBS洗板6次,每 孔加入100 μl 亲和素标记的碱性 磷酸酶,室温放置1~2h。
6. 加底物显色:用0 .05%
酶标板
Tween20-PBS洗板6次,每孔加入100μl BCIP/NBT底物液,室温避光静置10 min 至 1h。
流水冲洗,晾干。
7.计数:肉眼或解剖显微镜下计斑点数(见图14-3)。
(四)注意事项
  1. 细胞数量必须适中,太多会造成斑点过密甚至融合,无法计数;太少则不能显 现可见斑点。 一般细胞数量控制在5×10⁴~2×10⁵/孔之间,具体数量视实验中刺激剂 强度及细胞类型而定,需预实验摸索。如采用PHA 刺激PBMC 检测IFN-y 时,细胞数 甚至可降低至1×10⁴/孔。
细胞培养

2. 加入细胞后,需小心将酶标板平放入孵箱中静置,孵育期间不要移动酶标板, 以免分泌细胞因子的细胞移动,造成斑点模糊甚至重叠。
3. 加入细胞培养前的所有步骤需注意无菌操作。
4. 显色过程必须避光。每步洗涤要充分,否则背景会增高。

来源:苏州阿尔法生物


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