内切酶是一类能够识别并切割特定脱氧核苷酸序列的酶，不同类型的内切酶在切割机制上存在差异。以下将详细介绍不同类型内切酶的切割机制差异。

一、限制性内切酶

限制性内切酶主要分为三种类型：Type Ⅰ、Type Ⅱ 及 Type Ⅲ。

Type Ⅰ 限制性内切酶：既能催化宿主 DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的水解。其切割机制较为复杂，通常需要多个亚基协同作用，识别特定的 DNA 序列后，在远离识别位点的地方进行切割。

Type Ⅱ 限制性内切酶：只催化非甲基化的 DNA 的水解。Type Ⅱ 限制性内切酶所识别的位置多为短的回文序列，所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。这类内切酶在基因工程上实用性较高，如 EcoRⅠ、HindⅢ 等。其切割机制相对简单，通常由单一的蛋白质亚基组成，识别特定的 DNA 序列后，在识别位点处进行切割。

Type Ⅲ 限制性内切酶：同时具有修饰及认知切割的作用。其切割机制与 Type Ⅰ 和 Type Ⅱ 有所不同，通常需要多个亚基协同作用，识别特定的 DNA 序列后，在识别位点下游一定距离处进行切割。

二、归巢内切核酸酶

LAGLIDADG 归巢内切核酸酶：是可用于基因组编辑应用的位点特异性移动核酸内切酶。其切割机制涉及对 DNA 形状和柔韧性的间接读出，特别是在发生切割的中心 4 个碱基处。通过功能选择和深度测序分析发现，野生型活性位点并非对所有底物都是最佳的，新的活性位点残基组合可以支持在野生型酶难以裂解的底物上的活性。例如，两个金属结合残基中 E 或 D 取代的组合极大地影响了切割活性，而 E184D 变体具有更宽的切割特性。对 I-LtrI E184D 和与非同源 AACC 中枢 4 序列共结晶的野生型蛋白质的分析显示，结构差异与切割单个 DNA 链的动力学常数相关。

其他归巢内切核酸酶：许多微生物的基因组中含有编码罕见切割归巢内切核酸酶的遗传元件，这些内切酶有助于编码它们的元件（如自剪接的 I 组和 II 组内含子以及在某些情况下的内含肽）的移动。归巢内切核酸酶有几个不同的家族，它们启动和靶向特定序列进行横向转移的能力使其成为有吸引力的基因靶向试剂。归巢内切核酸酶已被应用于促进 DNA 修饰或基因组编辑，如基因修复或 “基因敲除”。对归巢内切核酸酶的工程改造策略也在不断发展，以改变其靶位点特异性。

三、限制性核酸内切酶 CglI

   来自谷氨酸棒状杆菌的限制性核酸内切酶 CglI 识别不对称的 5'-GCCGC-3' 位点，并在依赖于 NTP 水解的反应中切割顶部和底部 DNA 链下游的 DNA 7 和 6/7 核苷酸。CglI 由两种不同的蛋白质组成：核酸内切酶（R.CglI）和 DEAD 家族的解旋酶样 ATPase（H.CglI）。这些亚基与化学计量比为 R2H2 形成异四聚体复合物。然而，R2H2・CglI 复合物仅具有一个足以切割一条 DNA 链的核酸酶活性位点，这表明引入双链断裂需要两个复合物。CglI 不需要在同一 DNA 上的两个位点即可获得最佳催化活性，但单点线性 DNA 的底物较差，支持了一种机制，其中 CglI 复合物必须在激活切割之前沿一维 DNA 轮廓连通。CglI 水解三磷酸腺苷（ATP）会优先在 DNA 上从靶标的下游方向产生易位，尽管上游易位也是可能的。这种作用机制与其他 ATP 依赖性限制性修饰酶不同。

四、HigB 毒素切割核酸内切酶

   HigB 毒素是一种与核糖体结合的核糖体依赖性毒素，其切割核酸内切酶的机制如下：解决了绑定到核糖体的野生型，核糖体依赖性毒素 HigB 的 X 射线晶体结构，揭示了 mRNA 底物附近的潜在催化残基。使用基于细胞和生化分析，确定 HigB 残基 His54，Asp90，Tyr91 和 His92 对于体内活性较重要，而 HigB H54A 和 Y91A 变体对体外 mRNA 切割的影响大。比较具有 70S-HigB 结合结构的两个催化惰性 HigB 变体的 X 射线晶体结构，发现 HigB 活性位点残基可能经历构象重排，可能需要识别其 mRNA 底物。

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