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实时荧光定量 PCR（qPCR）是生命科学领域的革命性技术，能在 PCR 扩增过程中实时监测荧光信号，实现对靶基因的精确定量。荧光定量 PCR 已成为分子生物学领域的金标准技术，但其特异性优化仍是许多研究者面临的挑战。
然而，PCR 特异性问题始终困扰着许多研究人员。非特异性扩增不仅会导致实验结果不准确，还会浪费宝贵的样本和时间。本文将详细介绍提高 PCR 特异性的九大方法，并结合最新市场数据，帮助您选择适合的荧光定量 PCR 仪器和试剂。
一、引物设计：特异性扩增的基石
细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。
引物设计的关键原则
• 长度适宜：典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，但大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。
• GC 含量合理：选择 GC 含量为 40％到 60％或 GC 含量映像模板 GC 含量的引物。设计 5' 端和中间区为 G 或 C 的引物，增加引物稳定性。
• 避免二聚体：避免引物对 3' 末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
• 3' 末端设计：避免 3' 末端富含 GC，保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。避免 3' 末端的错误配对。
• 二级结构：避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
使用 NCBI Primer-BLAST 工具进行引物设计，注意跨外显子连接区设计，避免基因组 DNA 扩增。
二、引物退火温度：精确控制的关键
熔解温度（Tm）是当 50％的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度。Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。
优化策略
• 合理的退火温度从 55℃到 70℃，一般设定比引物的 Tm 低 5℃。
• 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值（差异不超过 5℃）。
• 可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性，以 2℃为增量逐步提高退火温度。
递减 PCR 通过在 PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环开始在比估算的 Tm 高大约 5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低 1℃到 2℃，直到退火温度低于 Tm 5℃。
这种方法只有同源性最高的目的模板会被扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
可以使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过 Beers 法则计算引物浓度。避免使用寡聚核苷酸作为标准在 EB 染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。
定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。但部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。
引物保存建议
• 最好在 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100μM。
• 将干粉和溶解的引物储存在 - 20℃。
• 大于 10μM 浓度溶于 TE 的引物在 - 20℃可以稳定保存 6 个月。
• 干粉引物可以在 - 20℃保存至少 1 年。
热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性，因此在进行 PCR 反应配制过程中会产生非特异性的产物。
Platinum Taq DNA 聚合酶对于自动热启动 PCR 来说方便高效。同经化学修饰用于热启动的 Taq DNA 聚合酶相比，Platinum 酶不需要在 94℃延时保温（10 到 15 分钟）以激活聚合酶。
镁离子影响 PCR 的多个方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。包含 200μM dNTP 的典型 PCR 起始浓度是 1.5mM（对实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液）。
为了确定最佳浓度，从 1mM 到 3mM，以 0.5mM 递增，进行镁离子滴定。Platinum Taq DNA 聚合酶能够在比 Taq DNA 聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。
对于高 GC 含量的模板等困难模板，需要添加辅助物质。PCR 添加剂包括甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱以及 PCRx Enhancer Solution 可以增强扩增。
它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助 DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制 Taq DNA 聚合酶的 DMSO、甲酰胺和甘油。
使用巢式引物进行连续多轮扩增可以显著提高特异性和灵敏度。第一轮是 15 到 20 个循环的标准扩增，将一小部分起始扩增产物稀释 100 到 1000 倍加入到第二轮扩增中进行 15 到 20 个循环。
在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式 PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。
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朗基荧光定量PCR仪型号参数对比 |
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型号 |
T30 |
A300 |
A200 |
Mini3220 |
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屏幕 |
10.1" TFT高清真彩全触控屏 |
7" TFT高清真彩全触控屏 |
7" TFT高清真彩全触控屏 |
4.3" TFT彩色触摸屏 |
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角度可调 |
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样品台 |
3组32孔×0.2ml独立样品台 |
可选：96孔/9677孔/384孔/多功能模块 |
可选：96孔/9677孔/384孔/多功能模块 |
32孔×0.2ml |
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可同时运行三个不同程序 |
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升降温系统 |
美国MARLOW半导体芯片 |
美国MARLOW半导体芯片 |
美国MARLOW半导体芯片 |
最新一代半导体技术 |
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升温≥7.5℃/秒 |
升温6℃/秒 |
升温5℃/秒 |
升温5℃/秒 |
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循环次数≥100万次 |
降温5℃/秒 |
降温5℃/秒 |
降温4℃/秒 |
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温控性能 |
温度范围：0-105℃ |
温度范围：0-105℃ |
温度范围：0-105℃ |
温度范围：0.1-99.9℃ |
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精度：≤±0.1℃ |
精度：≤±0.1℃ |
精度：≤±0.1℃ |
精度：±0.25℃ |
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均匀性：≤±0.2℃ |
均匀性：≤±0.2℃ |
均匀性：≤±0.2℃ |
均匀性：±0.25℃ |
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梯度PCR |
支持 |
支持 |
支持 |
不支持 |
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梯度范围：30-105℃ |
梯度范围：30-105℃ |
梯度范围：30-99.9℃ |
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8行梯度温度 |
12列梯度温度点 |
12列梯度温度点 |
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特殊功能 |
可升级为三槽定量PCR仪 |
支持原位功能 |
支持时间/温度递变功能 |
变温速度可调 |
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模块化设计，用途灵活 |
时间/温度递变功能 |
Long PCR、Touchdown PCR |
适合基础扩增需求 |
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可连接电脑远程控制（最多50台） |
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程序存储 |
主机存储15,000个程序 |
主机存储15,000个程序 |
主机存储10,000个程序 |
存储大于100个程序 |
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U盘无限量下载 |
U盘无限量下载 |
U盘无限量下载 |
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售后服务 |
质保3年 |
质保1年 |
质保1年 |
质保1年 |
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参考价格 |
￥38,000左右/台 |
面议 |
1-3.5万 |
￥22200左右/台 |
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核心应用场景 |
高端科研、高通量筛选 |
综合性分子生物学实验室 |
常规PCR实验、教学实验室 |
入门级、预算有限 |
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需要极致速度和精准度的实验室 |
需要灵活模块和远程管理的用户 |
性价比之选 |
少量样本基础扩增 |
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实验质量控制要点
为确保 qPCR 实验结果可靠性，必须设置以下五种必要对照：
• NTC（无模板对照）：监测引物二聚体 / 体系污染。
• NRT（无逆转录对照）：检测 gDNA 残留。
• 阳性对照：确认反应体系有效性。
• 标准曲线：计算引物扩增效率。
• 内参对照：样本间归一化基准。
提高 PCR 特异性需要综合考虑引物设计、反应条件优化和添加剂使用等多个方面。通过本文介绍的九种方法，您可以显著提高 PCR 反应的特异性，获得更加可靠实验结果。
同时，选择高质量的 PCR 仪器和试剂也是确保实验结果重复性的重要因素。根据您的实验需求和预算，选择适合的荧光定量 PCR 仪，将有助于您获得更加准确和可靠的实验结果。
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方法 |
关键点 / 原理 |
适用场景 / 注意事项 |
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引物设计 |
长度 18 - 24nt，GC 含量 40% - 60% ，避免 3' 端互补及二级结构 |
所有 PCR 实验，是提高特异性的基础 |
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退火温度优化 |
设定比 Tm 低 5℃，逐步提高温度以提高特异性 |
当出现非特异性条带时，需进行温度优化 |
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递减 PCR |
前几个循环使用高退火温度，随后每个循环降低 1 - 2℃ |
适用于引物和模板同源性程度未知的情况（如 AFLP 分析） |
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引物浓度优化 |
最佳浓度一般为 0.1 - 0.5μM，高浓度易导致非特异性扩增 |
当引物效率不高时，可适当优化浓度 |
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热启动 PCR |
通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到高温才启动 |
适用于位点设计受限的情况（如定点突变、表达克隆） |
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镁离子浓度优化 |
典型起始浓度为 1.5mM，可进行 0.5mM 递增的浓度梯度优化 |
对实时定量 PCR，使用 3 - 5mM 镁离子溶液（用荧光探针时） |
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PCR 添加剂 |
DMSO、甘油、甜菜碱等可降低熔解温度，有助于通过二级结构区 |
高 GC 含量模板等困难模板的扩增 |
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巢式 PCR |
使用两套引物进行两轮扩增，大幅提高特异性和灵敏度 |
稀有模板的检测（如稀有 mRNA），或困难 PCR（如 5' RACE ） |
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引物纯化与保存 |
保存在 - 20℃（TE 溶解），避免反复冻干，长引物需纯化除去截断序列 |
确保引物质量，避免因引物问题影响实验 |
苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年，位于苏州园区生物纳米园（Biobay）A5幢301室。公司管理团队专注于科学仪器行业十四年，拥有专业的技术团队与完善的售后服务体系，目前已为300余家实验室提供优质产品和服务，涵盖各大高校、检测中心、科研机构、制药企业等13个群体。提供的实验室仪器主要包括振荡培养箱，恒温恒湿培养箱、二氧化碳培养箱、生化培养箱、霉菌培养箱、PCR仪，瑞宁移液器，生物反应器，发酵罐，超低温冰箱，液氮罐，高压灭菌器，超纯水机，天平，离心机，离心浓缩仪、研磨机、葡萄糖乳酸分析仪等。厂商企业授权包括知楚仪器、朗基、中科美菱，梅特勒，乐枫，搏旅、NEST、天根、奥盛在内的80个余厂家。
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