贴壁细胞传代培养是生物学研究中常常遇到的基本实验。

一、目的
建议使用以下方案作为 贴壁细胞传代培养的基本指导。

二、责任
所有经过培训的实验室人员都有责任执行并遵守程序的所有方面。管理层有责任验证执行规定程序的技术方面人员的资格。

三、细胞生物学中常见的名词定义：

1.类上皮细胞——细胞呈多边形，尺寸更规则，并以不连续的斑块附着在基质上生长。

2.成纤维细胞（或成纤维细胞样）——在基质上生长的细胞看起来细长且双极，在重度培养中经常形成漩涡。

3.永生或连续细胞系——已适应在培养物中无限期生长的细胞。

4.淋巴母细胞样 – 球形细胞，通常在悬浮液中生长，不附着在表面上。

5.单层培养系统——主要生长在均匀层中的玻璃或处理过的塑料上的细胞。

6.传代数——细胞经历的传代培养次数。传代数应与每个亚培养物一起记录。

7.原代培养——源自有机体并置于合适培养环境中的细胞。

8.衰老——分子和细胞结构的累积变化会随着时间的推移破坏新陈代谢，导致恶化并最终导致细胞死亡。

9.继代培养或传代——去除培养基并将细胞从以前的培养物转移到新鲜的生长培养基中，使细胞系能够继续繁殖。

10.悬浮培养系统 – 培养系统中的自由漂浮细胞。

11.组织培养——从动物或植物中取出细胞、组织或器官，然后置于有利于生长的人工环境进行培养的过程。

四、贴壁细胞传代培养时需要的实验室 设备
实验设备将针对指定用途进行适当设计，并适当放置和安装以方便操作，包括清洁和维护。实验室仪器将根据既定程序和时间表进行清洁、消毒、维护和校准。培养培养过程中通常会用到的实验室仪器如下：

1.移液器，移液枪（rainin）

2.水浴锅

3.温度计

4.倒置光学显微镜

5.离心机

6.CO2 培养箱，能够在 5% CO2 的湿润气氛下维持 37°C

实验耗材和实验试剂
培养容器包含处于健康生长阶段的细胞或冷冻保存的细胞，这些细胞在冷冻保存前至少有 90% 的存活率。细胞培养操作中使用的实验耗材主要包括离心管、培养板、细胞培养瓶、无菌一次性培养皿、细胞培养板、移液器吸头、一次性移液管、乳胶手套等；液体培养基和添加剂、血清等。还包括实验室消毒液、细胞培养基、胰蛋白酶、0.4%台盼蓝、抗生素和适当的细胞培养添加剂、不含钙镁的平衡盐溶液、适用于细胞类型的牛血清等

细胞规格
培养物应保持在对数生长期（70-80% 汇合）。培养条件取决于细胞系。所有与细胞培养物接触的溶液、设备和耗材都必须是无菌的。绝不能同时处理不同的细胞系。在准备不同类型的细胞之间，应彻底清洁所有工作区域。

预防措施
穿戴个人防护装备。使用适当的无菌技术。

贴壁细胞传代培养步骤

1. 细胞生长培养基的制备。

A. 检查与细胞系有关的信息，以确定应使用何种培养基类型、添加剂和建议。遵循制造商对细胞培养容器工作体积的建议。

B. 基础培养基补充有 5-20% 的牛血清，通常还添加抗生素、生长因子、氨基酸或糖。一旦补充基础培养基以产生完全培养基，它通常可以在 4°C 下稳定 6 周。

2. 细胞检查

A. 应经常在显微镜下检查细胞，以确保它们健康并按预期生长。贴壁细胞应主要贴附在烧瓶底部，呈圆形、丰满或细长的形状，并在其膜周围折射光线。检查与细胞系有关的信息，以确定应使用何种培养基类型、添加剂和建议。遵循制造商对培养容器工作体积的建议。

B. 观察培养细胞的健康状况、形态、汇合度百分比、细胞碎片、污染等。

C. 如果细胞大量脱落并且看起来干瘪、呈颗粒状或颜色深，或者它们似乎根本没有生长，或者看起来已被污染，则丢弃细胞。

3. 拆分比率

A. 分流比可用于确保细胞应为实验做好准备。查看正在使用的细胞系的指南。如果使用高分流比，一些生长缓慢的细胞可能不会生长。一些快速生长的细胞可能需要高分流比以确保它们不会过度生长。作为一般指南：

A. 1:2 分流应达到 70-80% 汇合，并可在 1-2 天内进行实验

B. 1:5 分流应达到 70-80% 的融合度，并可在 2-4 天内进行实验。

B. 如果细胞汇合度低于 70-80% 但需要传代培养，则应以较低的比例分流，以便以足够高的密度接种细胞以使其存活。

4. 继代培养或传代

A. 从培养容器中取出并丢弃用过的细胞培养基。

B. 使用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞。

A. 每 10cm2 培养表面积约 2mL。轻轻地将洗涤液添加到容器与附着的细胞层相对的一侧，以避免干扰细胞层。轻轻来回摇动容器数次以清洗细胞层。

B. 从培养容器中取出并丢弃洗涤液。

C. 重复洗涤步骤，共洗涤两次。

C. 将预热的解离试剂添加到烧瓶的一侧。使用足够的试剂覆盖细胞层，每 10cm2 约 0.5ml。轻轻摇动培养容器，使解离试剂完全覆盖细胞层。

A. 在室温下孵育培养容器约 2-3 分钟。实际孵育时间因使用的细胞系而异。难以分离的细胞可置于 37°C 以促进分散。

B. 在显微镜下观察细胞是否脱离。如果细胞分离率低于 90%，则将孵育时间增加几分钟，每 30 秒检查一次解离情况。

a. 分离的细胞呈圆形并处于悬浮状态。根据细胞系的不同，培养容器可以轻轻敲击烧瓶的侧面。注意：为避免结块，在胰蛋白酶中不要通过敲击来搅动细胞。

b. 不要让细胞在解离培养基中停留超过 10 分钟。

C. 吸出细胞悬液并转移到锥形管中。

D. 添加相当于 2 体积的预热完全生长培养基。通过在细胞层表面上吹打几次来分散介质。将细胞悬浮液转移到离解介质中含有细胞的管中。细胞悬浮液可以计数用于冷冻保存，或者细胞可以离心用于传代培养。

E. 以 200-1000xg 离心细胞 5 到 10 分钟。离心速度和时间将根据细胞类型而有所不同。

F. 将细胞沉淀重新悬浮在最小体积的预热完全生长培养基中，并取出样本进行计数。

G. 将细胞悬液稀释至细胞系推荐的接种密度或分流比。将适当的体积吸取到新的培养容器中，然后将细胞放回培养箱。

更换培养基

A. 如果细胞在几天内生长良好但尚未融合，则可能需要更换培养基以补充营养。如果悬浮液中有大量细胞或培养基 pH 值开始变酸，请更换细胞培养基。

B. 将完整培养基加热至 37°C。小心地从培养容器中吸出培养基并丢弃。更换为新鲜的预热完全培养基并返回培养箱。

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