EBV，也称为人类疱疹病毒 4，是淋巴隐病毒属的一种伽马疱疹病毒. 它是传染性单核细胞增多症的原因，并与多种人类肿瘤疾病有关，包括伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。大多数成年人的 EBV 血清反应呈阳性，表明其在人群中普遍存在。感染通常是潜伏的。然而，外植的淋巴瘤细胞有时会产生传染性病毒。几十年前，来自淋巴瘤外植体的细胞系的上清液被用于确认 EBV 感染的肿瘤潜力，这是通过病毒介导的细胞培养中人血 B 淋巴细胞的永生化。从那时起，B 淋巴细胞的 EBV 体外转化已成为获得用于诊断和研究的人类细胞系的常规程序。

一、实验材料的准备：

1.二甲基亚砜 (DMSO)

2. 培养基

 IMDM、RPMI-1640、胎牛血清

3.抗生素

青霉素/链霉素溶液，10,000 IU/mL 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素 ( ATCC 30-2300 )

4.PBS缓冲液，不含钙和镁

5.来自 EBV 表达细胞的过滤上清液

6.经辐照的 MRC-5 贴壁细胞

注意：经辐照的 MRC-5 细胞包装为冷冻悬浮液，每瓶 1 毫升。每个小瓶足以接种高达 225 cm 2的表面积（9 - T-25 烧瓶）

二、生物实验器材的准备

冻存管

去纤维蛋白或抗凝剂处理的全人血

Histopaque-1077 Ficoll 梯度溶液或Sigma-Aldrich 

25 cm 2 (T-25) 细胞培养瓶，细胞培养处理

75 cm 2 (T-75) 细胞培养瓶，细胞培养处理

15 mL 无菌聚苯乙烯离心管，带盖

实验目的：使用EBV 制剂 转化您的B 淋巴细胞从而获得 VR-1492。

实验时的注意事项：

所有工作都应在 BSL-2 条件下使用无菌技术完成，并使用处理血液制品的通用预防措施。B95-8 细胞还可能携带和分泌一种可传播的 D 型逆转录病毒，松鼠猴逆转录病毒 – B95-8 (SMRV-B95-8)，它可以感染人类 B 和 T 细胞系。这种逆转录病毒不会干扰 EBV 的转化能力。

实验步骤：

1.将 0.1 mL DMSO 分配到标记的冷冻管中用于血液储存。

2.从容器中汇集去纤维蛋白或抗凝剂处理过的血液。

3.每个冻存管分配 0.9 mL 的血液，定期混合以确保均匀的细胞悬浮液。盖上小瓶并轻轻混合。

4.在 -80°C 的乙醇中将小瓶冷冻在冷冻保存容器中 3-18 小时，或以每分钟 1°C 的速度冷冻。

5.将冷冻保存的血液小瓶储存在液氮中。

6.在用于转化前 1-5 天准备饲养层。

7.通过将 FBS 添加到 EMEM 或 IMDM 到 10% v/v 和青霉素/链霉素溶液到 1% v/v (1X) 来制备完整的培养基。

8.解冻一瓶经辐照的 MRC-5 单层细胞，并在无菌 50 mL 锥形管中与 27 mL 完整培养基混合。

9.每个 T-25 烧瓶（~4 × 10 5 个  细胞）分配 3 mL 细胞悬浮液。 

10.第二天用显微镜检查培养瓶。理论上应该是大约 30% 重合。

注意：培养后1-5天用于转化。

淋巴细胞处理步骤：

1.准备用于转化的淋巴细胞

2.将 3 mL 的全血（新鲜或解冻）与等体积的 PBS 或 RPMI-1640 混合。

3.使用 Ficoll 从红细胞和粒细胞中分离淋巴细胞。

4.在 15 mL 聚苯乙烯离心管中，将稀释的全血小心地铺在 4.5 mL 的室温 Histopaque-1077 上。

5.在室温下以 400 × g 离心 40 分钟。

6.取出并丢弃上层透明等离子层，使其距离中间层0.3 cm 2以内。

7.将中间层的不透明淋巴细胞带和 Histopaque-1077 层转移到管底部颗粒的0.3 cm 2 内，转移到新的 15 mL 离心管中。

8.用含 20% FBS 和青霉素/链霉素的 IMDM 填充管；将试管充分混合并以 260 × g 离心 15 分钟。取出并丢弃上清液

9.用 10% FBS 和青霉素/链霉素在 10 mL IMDM 中重新悬浮细胞颗粒；以 260 × g 离心 15 分钟，混合并收集细胞。取出并丢弃上清液。

10.用 10% FBS 和 1X 青霉素 /链霉素在 3 mL IMDM 中重新悬浮细胞颗粒。

11.使用染料排除方法对所得淋巴细胞制剂进行可行计数。

12.立即使用细胞进行转化或将它们冷冻以备将来用于全血。

三、设置转化培养物（建议每个样品使用 2 个培养瓶） 

1.每个转化瓶解冻 1 瓶人类 gammaherpesvirus 4 (HHV-4) ( VR-1492) (1 mL) 。 

2.从饲养层中取出培养基。

3.  每瓶需要添加：2 毫升 IMDM 与 20% FBS；1 mL 淋巴细胞悬液，含有 1-6 × 10 6淋巴细胞；1 毫升（1 瓶）人伽马疱疹病毒 4 (HHV-4) (ATCC VR-1492)。

4.在 5% CO 2浓度下， 37°C 混合培养，持续观察转化细胞的培养物

5.启动后 7 天，观察每个烧瓶的转化迹象并添加 4 mL 新鲜培养基（ IMDM，含 20% FBS 和 1X 青霉素/ 链霉素）。

6.淋巴细胞转化的早期迹象包括锥形细胞、具有尖峰状突起的细胞和具有折射性的、看起来健康的细胞簇。

7.转化的后期迹象包括培养物的浊度增加和培养基的酸化，表现为变黄。

8.此后每 3-4 天，检查培养物是否有转化迹象并添加新鲜培养基。

9.小心地取出 3-4 毫升培养基而不去除细胞。

10.加回相同体积的完全培养基（含 20% FBS 和 1X 青霉素 /链霉素的 IMDM）。

11.扩大转化培养物以建立淋巴母细胞系

12.将细胞从密集的 T-25 摇瓶瓶转移到 T-75 摇瓶，并添加足够的 IMDM 和 10% FBS 和青霉素/链霉素，以获得每毫升 1-3 × 10 5细胞的细胞密度。

13.通过添加培养基，将 T-75 摇瓶中的细胞密度保持在每毫升1-3 × 10 5 个细胞。

14.扩展到额外的烧瓶以将细胞密度保持在 1-3 × 10 5细胞/mL。

15.以每毫升3-5 × 10 6 个细胞的速度冷冻转化细胞以供保存和以后使用

16.完成活细胞计数以确定悬浮液中细胞的密度和活力以及保留待冷冻的细胞总数。

17.通过以 260 × g 离心 15 分钟从培养液中收集细胞。

18.丢弃上清液并将细胞颗粒重新悬浮在一定体积的冷冻冷冻介质中（IMDM，含 10% FBS 、青霉素/链霉素和 10% DMSO），细胞密度为每毫升3-5 × 10 6 个细胞。

19.将产生的细胞悬浮液分配到标记的冷冻管中。

20.将小瓶在乙醇中的冷冻保存容器中在 -80°C 下冷冻 3-18 小时，或以每分钟 1°C 的速度在受控速率冰箱中冷冻，然后将它们储存在液氮中。

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