通过下一代测序 (NGS) 来验证，能够在核苷酸水平分辨率下进行大规模评估基因编辑的准确性和可靠性。高效、可自动化和可扩展的 CIRCLE-seq 是一种体外 NGS 测定，可以对 CRISPR 介导的切割进行灵敏的脱靶检测。

CRISPR-Cas9 基因编辑

CRISPR 代表成簇规律间隔的短回文重复序列。这些重复的 DNA 片段最初来源于病毒病原体，并作为模板将 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 核酸内切酶引导至新入侵的病毒。当 Cas9 遇到同源病毒序列时，它会产生近端双链断裂 (DSB)。类似地，当 Cas9 和指导 RNA (gRNA) 被转染到哺乳动物细胞中时，接近 gRNA 的同源序列被切割。然后通过内源性易出错的非同源末端连接 (NHEJ) 过程将末端重新连接在一起，或使用外源提供的供体（修复）模板通过同源定向修复 (HDR) 进行修补，从而修复 DSB。

研究人员使用 HDR 以已知且可预测的方式改变基因序列。gRNA 决定编辑将在何处进行，而供体模板 DNA（其末端与 DSB 站点共享同源性）决定编辑的外观。

由于这些是关键组件，因此确保 gRNA 和修复模板没有错误非常重要。使用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶等优质试剂进行扩增有助于确保准确性和特异性。

NGS 验证法

   即使使用的聚合酶为 CRISPR HDR 生成准确的修复模板，实验室也需要一种方法来验证基因编辑是否成功——编辑的位点包含预期的序列。NGS 提供了一种高通量、自动化友好的方法来验证克隆分离物中的目标基因编辑。

   为了从 NGS 中获得最佳结果，强大的文库制备必不可少。Dana-Farber 癌症研究所的分子生物学核心设施 (MBCF) 发现 KAPA HyperPrep 试剂盒提供的工作流程能够适应各种扩增子输入量和大小，从而最大限度地减少输入 QC 和特定样本工作流程修改的需要. 使工作流程适应他们的自动液体处理系统，允许在大约 3-1/2 小时的仪器时间内基于扩增子的文库制备 96 个克隆样本。

CRISPR的切割位点的优化

   验证预期的位点是否已成功修改是一回事，但无论计算机设计多么彻底，基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑中使用的 Cas9 核酸酶都有可能以类似的方式切割和改变非预期的目标序列。因此，实验室需要一种方法来识别可能的脱靶切割位点，并能够将这些位点与扩增导致的简单错误区分开来。有几种 NGS 工作流程可以实现这一点。

    例如，Digenome-seq 是一种相对简单的体外检测方法，其中使用 Cas9 核酸酶切割从目标细胞中提取的基因组 DNA，将 NGS 测序接头连接到所有游离端，并对生成的文库进行测序以鉴定削减。然而，由于文库没有针对切割位点进行富集，因此未修饰 DNA 的背景很高，需要大量的测序读数，并且很难找到罕见的切割事件。

GUIDE-seq 方法

   通过先在体内富集掺入 Cas9 引入的 DSB 中的寡核苷酸来降低测序成本。但它的灵敏度较低，并且作为一种基于细胞的检测方法，它既费时又费力，而且仅限于易于转染的细胞。

    CIRCLE-seq 代表 Circularization for In vitro Reporting of Cleaveage Effects by SEQuencing，它结合了灵活的体外工作流程和仅选择性测序 Cas9 切割的 DNA 的所有富集优势。1 随机剪切的基因组 DNA 被环化，然后用 Cas9 切割. 只有具有切割位点的分子才会进入文库制备、PCR 扩增和 NGS 的后续步骤，以揭示易受 Cas9 切割影响的序列。

     作为一种体外试验，CIRCLE-seq 避免了 CRISPR QC 基于细胞的方法中冗长的细胞培养步骤。此外，CIRCLE-seq 是一种可扩展、灵敏的技术，与其他体外方法相比，需要更少的测序读数，从而降低测序成本。CIRCLE-seq 的成功需要使用 CRISPR基因编辑试剂等进行高效的文库制备，可减少文库扩增过程中扩增偏差的高保真 DNA 聚合酶。

   基于 NGS 的工具可在每个阶段对 CRISPR/Cas9 介导的编辑进行核苷酸水平的验证。

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