CHO细胞重组蛋白补料分批培养策略

   近 80% 的CAR-T抗体由中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞产生。为了实现更好的细胞生长和高产重组蛋白，补料分批培养通常用于在 CHO 细胞中生产重组蛋白。根据营养物质消耗的需要，在细胞培养中加入含有多种成分的补料培养基，可以影响细胞生长特性，提高重组蛋白的产量和质量。补料分批优化应与 细胞培养环境参数、培养基 组成、补料策略等综合因素相 关联。

在重组蛋白表达系统中，中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞作为 RTP 生产的常用细胞主要以下几个优势：

①不易被人类病毒感染，安全性高；

② 具有类似于人类细胞的翻译后修饰的RTPs；

③ 高密度 CHO 细胞可以使用化学成分确定的无血清培养基 (CD-SFM) 进行悬浮培养，并产生分泌到培养基中的蛋白质。

如今，哺乳动物细胞培养中的 mAb 生产主要通过大型生物反应器中的补料分批工艺进行。CHO 细胞通常以分批补料模式培养，以实现较大细胞密度和产物滴度，连续或推注补料添加。初始细胞生长由基础培养基支持。在补料分批培养中添加浓缩补料培养基以补充营养并延长培养时间。补料培养基可以避免营养限制，并可以促进重组蛋白的更高产量。补料分批处理后静止期细胞的培养时间比分批培养长。补料分批培养需要了解细胞生长和细胞代谢的特征，以及影响 RTP 质量和产量的关键工艺参数。CHO 细胞在指数期高速生长，葡萄糖和氨基酸的消耗加速，导致乳酸和铵的积累需要使用葡萄糖乳酸分析仪对乳酸变化进行分析。在补料分批培养中，温度、pH 和其他工艺参数也会对抗体表达和质量属性产生影响。

CHO细胞培养

贴壁 CHO 细胞在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM/F12 培养基中于 37℃、5% CO 2条件下生长。选择 SFM 进行悬浮培养，支持从贴壁培养到悬浮培养模式的转变。基础培养基用于贴壁培养，包括来自胎牛的血清成分。血清成分复杂，容易受到污染。SFM分为普通无血清培养基、无异源培养基、无动物培养基、无蛋白培养基和化学成分确定的无血清培养基; . 在细胞悬浮培养方面，SFM可以有效避免血清培养带来的污染、纯化困难等缺点。

  分批培养是指加入一次SFM后，一次性收获重组蛋白的培养方法。由于样品采集时培养时间短和细胞密度不理想，RTP 生产不理想。补料分批模式提高了 RTP 生产。据报道，补料分批培养中的 mAb 滴度已达到 10 g/L 以上。近年来，流加工艺已成为大规模生产RTPs的重要生产工艺。然而，保持细胞的高生产力和蛋白质的质量属性仍然是一个挑战。因此，流加培养已经从单纯的高产重组蛋白转向了高产和高质量生产的双重目标.

补料分批培养环境参数

培养环境的参数会直接影响 CHO 细胞生长、重组蛋白表达、以及蛋白糖基化、细胞代谢物等 。细胞通过细胞培养瓶或摇瓶进行扩增，然后在生物反应器中进行培养。一台生物反应器主要参考的培养环境参数有温度、溶解氧 (DO值) 、pH值 和代谢产物积累等方面。

1.温度对CHO细胞生长的影响

实践证明，低温对完整细胞密度、细胞活力和细胞比生产力具有积极影响。培养降温一般在指数生长期进行。为了减少细胞凋亡和促进抗体合成，将培养温度从 37 ℃ 切换到 29 ℃ 至 35 ℃ 的较低温度。

2.渗透压对CHO细胞生长的影响

在补料分批培养的培养后期，补充营养物质和代谢副产物积累都能够增加细胞外渗透压。在补料分批培养过程中，可以适当通过NaCl,CaCl2,MgCl2等物质来逐渐适当地增加渗透压,以增加 mAb 的滴度，减少半乳糖基化，并适当增加高甘露糖糖基化的比例，提高生产效率。

3.酸碱度

  正常情况下CHO 细胞适宜的 pH值 范围为 7.2 ~ 7.6之间。所以，优化细胞培养物的 pH 值才能生产除高质量的重组蛋白。比如在将表达VEGF-MA 的CHO细胞放在在3L生物反应器中悬浮培养时，使用碳酸氢钠进行pH值的调整。当pH值设为7.10时，VEGF-MA的产量甚至达到4.1 g/L ，而电荷异质性、糖基化水平、蛋白质纯度分别可以达到26.1%、59.1%和95.1%. 如果细胞培养物的 pH 值保持在 6.8 以下或 7.6 以上，CHO 细胞的生长就会受到负面影响。所以通过控制适宜的PH生长环境可以起到促进CHO细胞生长的作用，从而实现重组蛋白的大规模生产。

4.解氧

DO 是大规模过程中的关键环境参数之一，它影响细胞生长和重组蛋白生产。CHO 细胞中的大多数 DO 值通常在 20% 到 50% 的范围内。据报道，在补料分批培养模式下，当 DO 值为 20% 时，重组促甲状腺激素 (rTSH) 的滴度为 1.6 mg/L  当 DO 值调整为 40%，表达人 IgG1 mAb 的 CHO 细胞在提供有乙酸铜和柠檬酸铁的补料分批培养物中培养，mAb 的产量在 14 天的补料分批培养中可以达到 10 g/L 以上，从这里可以看出，乙酸铜和柠檬酸铁在减少了 man5 含量和 mAb 的酸性电荷变体的同时也增加了 G1F 的比例。 

补料分批培养中的代谢副产物

在细胞培养的后期，补料分批培养通常会储存乳酸和铵盐等副产物。高浓度的代谢副产物不利于细胞生长和抗体表达。CHO细胞中葡萄糖通过转运蛋白GLUT1转移到细胞质中，通过糖酵解产生大量丙酮酸。部分丙酮酸使用乳酸脱氢酶进一步转化为乳酸. 为了培养表达 Fc 融合蛋白的 CHO 细胞并减少补料分批培养中的乳酸积累，使用半乳糖作为碳源以减少乳酸积累。表达抗 HIV 抗体 VRC01 的 CHO-K1 细胞在补料分批培养中培养。从第 3 天开始每天添加补料培养基。在细胞接种 12 小时后，将 10 mM 和 30 mM NH 4 Cl 添加到 CHO 细胞培养基中。使用EKF葡萄糖乳酸测定仪进行葡萄糖乳酸分析与对照组相比，30 mM NH 4 Cl处理组VCD和培养时间明显减少，乳酸、葡萄糖、铵和谷氨酰胺等副产物积累。特别是，铵对抗体滴度和细胞特异性生产力有负面影响.

   另外，研究发现，向 CHO 细胞中添加包括α-酮戊二酸 (α-KG)、苹果酸和琥珀酸在内的 TCA 循环中间体可以减少补料分批培养中乳酸和铵的积累，并提高细胞特异性生产力和抗体滴度。在补料分批培养中设计连续补料策略。他们发现，由于 7 升生物反应器中有大量营养补料培养基，连续补料减少了乳酸和铵的积累。从而促进了C12抗体的产生。在补料分批培养中，应避免副产物。建议分批补料培养选择可用的补料策略，以降低代谢副产物积累的可能性和浓度。

恒化培养

  为了提高 RTP 的细胞特异性生产力，成功的策略需要控制培养基中的培养温度和葡萄糖浓度。不幸的是，细胞培养的变化会影响特定的增长率，尤其是在两个操作变量中。为了在 CHO 细胞中生产重组人组织纤溶酶原激活剂，研究者利用恒化器培养并设置三组关于喂养介质的 20 mM、30 mM 和 40 mM 葡萄糖浓度。实验发现 40 mM 葡萄糖浓度组限制了细胞生长，但它增加了 rh-tPA 和 G2/M 期细胞的细胞特异性生产力。此外，当温度条件为 33°C 时，使用EKF葡萄糖乳酸分析仪测定发现葡萄糖消耗和乳酸生成率降低。

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