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原生质体叶肉细胞瞬时表达
作者: 编辑: 来源: 发布日期: 2022.11.10
信息摘要:
实验中使用的试剂盒为天根植物DNA提取试剂盒。

原生质体叶肉细胞瞬时表达

1、 生长培养好的试验材料(一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片)

2、 在拟南芥开花前取样(30片叶子左右即可)

3、 切取叶片为0.5-1mm的细条(如果材料能达到每克107个原生质体, 10-20片叶子需要5-10mL酶解液)

4、 迅速将切下的样品转到酶解液中,要求完全浸没。

5、 黑暗条件下抽真空30min

6、 连续酶解,室温下23℃黑暗中静止酶解3h

7、 利用光学显微镜检查原生质体(30-50μm大小)

8、 在过滤前加入等量的W5溶液

9、 洗干净滤网,并用W5润湿,之后过滤

10、 离心100g1-2min沉淀原生质体,尽可能吸走上清,重复洗2

11、 重悬原生质体于W5中,保持在2*105 /ml,冰浴30min

12、 100g离心2min,尽可能吸走上清,利用MMG重悬,浓度约 2*105/ml

13、 加入10μL质粒(1000ng-2000ng )于2ml离心管中

14、 加入100μL原生质体(2*104个),轻轻混匀。

15、 110μL PEG solution,轻弹使充分混匀

16、 23℃室温孵育30min

17、 400-440μL W5混匀,终止反应

18、 100g2min 23℃离心,去上清,重复洗一次

19、 1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养

20、 20-25℃孵育16h以上

21、 取样制片观察


溶液配制:

1、 酶解液的配制(20ml


试剂 终浓度 质量/g
MES 20mM 0.08528 KOH调pH5.7
D-Mannitol 0.4M 1.45736
KCl 20mM 0.02982
macerozyme R-10 0.40% 0.08
Cellulase R-10 1.50% 0.3
55℃水浴10min,待冷却后再加以下试剂
CaCl2·2H2O 10mM 0.029402
BSA 0.10% 0.02
 
W5溶液配制(500mL
试剂 终浓度 质量/g
MES 2mM 0.19524 KOH调pH5.7
NaCl 154mM 4.49988
CaCl2·2H2O 125mM 9.18825
KCl 5mM 0.186375
MMG配制(100mL
试剂 终浓度 质量/g
MES 4mM 0.078096 KOH调pH5.7
D-Mannitol 0.4M 7.2868
MgCl2·6H2O 15mM 0.30495
PEG配制(10mL
试剂 终浓度 质量/g
PEG 4000 40% 4
D-Mannitol 0.2M 0.36434
CaCl2·2H2O 100mM 0.14701

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