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细胞转染新方法-免疫穿孔转染法的原理及过程
作者: 苏州阿尔法生物 编辑: 阿尔法 来源: 苏州阿尔法 发布日期: 2022.03.01
信息摘要:
     细胞转染现在是分子生物学的核心技术,也是基因制药的必要前提。免疫穿孔转染法技术是用涂有抗体并与特定细胞表面跨膜蛋白结合的珠子如何在…

     细胞转染现在是分子生物学的核心技术,也是基因制药的必要前提。免疫穿孔转染法技术是用涂有抗体并与特定细胞表面跨膜蛋白结合的珠子如何在移除珠子时在细胞中产生孔,从而允许用 DNA 或其他大分子转染细胞。这种通过免疫穿孔对细胞进行的独特靶向转染非常有效,并且减少细胞凋亡。

免疫穿孔转染法的原理

  转染细胞有多种方法,比如电穿孔 、脂质转染 、磷酸钙共沉淀 和 DEAE葡聚糖等方法 . 在这些方法中,只有电穿孔提供了将 DNA 和其他分子(如蛋白质)引入活细胞的可能性。目前的方法都不能针对特定类型的细胞进行转染。在这种新的细胞转染方法中,抗体包被的珠子与特定的表面抗原结合,然后通过混合将珠子从细胞中剪下:这会在细胞膜上形成瞬时孔,大分子可以通过这些孔进入。粒细胞、分化的人淋巴母细胞 HL-60 细胞通常在其表面表达 CD71。当在二甲基亚砜 (DMSO) 存在下诱导分化时,细胞停止表达 CD71,而是表达 CD11b。

免疫穿孔细胞转染法的基本过程

将涂有抗 CD11b 抗体 (DYNAFECT-CD11b) 或抗 CD71 抗体 (DYNAFECT-CD71) 的 DYNAFECT 珠子在旋转的上下混合器上以 33 rpm 在 22 °C 下混合 6 小时,与未诱导的 HL- 60 个细胞或用 DMSO 诱导 3 天的细胞。为了在 2-ml 微量离心管中混合,可将 10 7 个磁珠和 5×10 5 个细胞悬浮在含有 0.2 μg 编码绿色荧光蛋白的质粒 DNA 载体 pEGFP-C1(4.7 kb)的 0.5 ml 转染培养基(Dynal AS)中。转染后,使用磁力分离器去除磁珠,将细胞转移回组织培养基中并在分析前再培养 48 小时。

细胞转染方法

   通过流式细胞技术来确定细胞转染的程度。 DYNAFECT-CD71 微珠促进 DNA 转染到正常的 HL-60 细胞中,但当细胞分化且不再表达 CD71 时,这些微珠不再发生转染。相反,将未分化的 HL-60 细胞与 DYNAFECT-CD11b 珠子混合不会导致细胞被 DNA 转染,但当细胞分化并开始表达 CD11b 时,这些磁珠确实会被转染。

    因此,免疫穿孔有可能靶向混合群体中特定类型的细胞进行转染,这取决于它们的免疫特性,并允许靶向细胞吸收各种不同的分子。这也发生在几种哺乳动物细胞系中,这些细胞系具有一系列针对选定细胞表面抗原的不同抗体。正常情况下,细胞转染水平为 40-80%,具体取决于混合条件,而无活力细胞的数量通常会少于20%。

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