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细胞划痕实验步骤
作者: 编辑: 来源: 发布日期: 2022.10.13
信息摘要:
细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上,待细胞融合后用枪头或其他硬物在中 央区域画一条线,这条线内的细胞被机械力去除掉了,然后将细胞继续…

细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上,待细胞融合后用枪头或其他硬物在中 央区域画一条线,这条线内的细胞被机械力去除掉了,然后将细胞继续培养,观察细胞向无 细胞的划痕区域迁移的情况,来判断细胞的迁移能力。其意义在于:价格低廉,操作简单, 还有很重要的一点在于细胞外围环境简单、单纯,容易控制,是肿瘤细胞基本的研究方法。

一、实验前准备

实验开始前,将离心管、吸管筒、移液枪、枪头,直尺等放入无菌超净工作台,以紫外 线照射 30min。然后,采用通风机通风 3min。 取出无菌 6 孔板,用黑色记号笔在 6 孔板底部,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔 0.5~1cm 一道,横穿过孔,每孔至少穿过 3 条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察 点,这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点,最终可以获得多个数据。 画好横线后,在板上分别做好标记。 取下试剂瓶和离心管上的封口膜,且将每个试剂瓶和离心管拧松,方便后续试验的操作。

二、细胞准备

取出处于对数生长期的健康细胞,吸掉原来的培养液,用无菌 PBS 清洗细胞。加入 1ml 胰酶消化液消化细胞,显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收 集细胞悬液于 15ml 离心管中,800rpm/min 室温离心 5min。用罗氏 CASY 快速细胞计数及 活率分析仪进行细胞计数,弃去上清,加入培养基重悬细胞。,以每孔 1~4×105 细胞的密度 接种到 6 孔培养板上,在含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中培养一天。具体数量因细胞种 类不同而不同,掌握为过夜能铺满。

三、直线划痕

取出铺满六孔板的细胞,用 200ul 枪头垂直于细胞表面,由孔一端划向另一端。尽量垂 直于背面的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈 #字形划痕。

四、PBS 清洗细胞及培养

吸掉旧培养基,用无菌 PBS 洗细胞表面 3 次,去除划下的细胞,加入含有 1%胎牛血清 的培养基为阴性对照,及含有相应浓度药物的 1%胎牛血清培养基为药物刺激组;每组 2 个 复孔。 轻轻摇动六孔板,使药物与细胞培养液充分混合,放入 37 度,5%C02 培养箱中培养。

五、结果观察

分别取划痕 0 小时、24hr、48hr 后观察不同处理组的痕道宽度。 结果可见:细胞划痕后 48h 观察到对照组细胞划痕宽度恢复约 90%,而药物抑制组恢 复约 60%。 表明加入药物后,由于药物的作用,使细胞迁移受到抑制,而未加入药物的细胞保持原 有的迁移能力,在 48h 后通过迁移将划痕掩盖。

六、注意事项

1、细胞密度 注意细胞生长状况,选择适当的细胞接种密度,对不同的细胞要观察其贴壁率等,保证 培养终止时密度适当。

2、冲洗细胞缓慢轻柔 在用 PBS 缓冲液冲洗时,注意贴壁缓慢加入,以免冲散单层贴壁细胞,影响实验拍照 结果。

3、低浓度或无血清培养 划痕 PBS 冲洗后应该加入无血清培养基或者低浓度血清培养基,以排除细胞本身增殖 对实验的影响。

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