T 细胞反应测定的6种方法

由于T细胞具有多种亚型，所以研究膜结合T细胞受体的技术困难，但在某些情况下，您希望能够做到这一点，例如分析哪些免疫记忆已被诱导以测量个体对特定抗原的反应程度。此时， 有多种方法可以实现，主要分为两大类：一种是通过测量特征性反应（例如细胞因子分泌）来检测 T 细胞对刺激作出反应的激活，另一种是通过细胞的特异性来分析T细胞受体。

下面总结了一下 T细胞分析的6种方法：

1. 限制稀释培养

该技术涉及通过使用不同稀释度的细胞来测量对特定抗原产生反应的 T 细胞的频率，然后测量无反应的孔数。

不用过多计算，简而言之，每个孔中活性 T细胞的分布应遵循泊松分布随机分布原则。我们可以使用这些信息来计算我们拥有的活跃 T 细胞的数量。从泊松分布中我们知道，如果反应阴性的孔比例为 37%，那么每个孔中平均有一个抗原特异性 T 细胞。因此读取产生 37% 阴性孔的细胞数，然后我们可以计算响应细胞的频率。例如，如果以每孔 5000 个细胞接种细胞导致 37% 的细胞呈阴性，我们知道我们有 1/5000 个活跃细胞的频率。启动或免疫小鼠后，频率相应增加，就表明抗原正在驱动增殖。

2. ELISPOT

如果需要对细胞进行表型分析，有限稀释培养法就显得费力些。此时可以可以通过细胞因子的产生来测量 T 细胞的反应，即：ELISPOT（酶联免疫斑点）进行检测。

方法步骤如下：在使用非反应性血清进行封闭之前，可以在 PVDF（聚偏二氟乙烯）覆盖的微孔板上涂上单克隆或多克隆抗体，并将板上的 T 细胞与一种或多种物质一起培养以激活细胞因子的分泌。然后细胞因子被包被的抗体捕获。接下来，在添加二抗之前清洗板以去除碎片、未结合的抗体和培养基，二抗与显色（着色）底物（通常是带有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的链霉亲和素）偶联，然后再次洗涤。然后，您可以将目的细胞因子视为可见点，并分别使用显微镜手动或自动使用自动阅读器对其进行计数。这种方法的缺点在于 虽然量化产生抗体的 T 细胞的数量方面相对较多，但在描述单个细胞的细胞因子产生谱时仍然受到限制。

3. 细胞内染色

细胞内染色是指在固定和透化细胞之前用蛋白质转运抑制剂（例如莫能菌素或布雷菲尔德菌素）处理来抑制细胞因子的分泌，并针对您的细胞因子的荧光标记抗体，并通过流式细胞术进行测量的方法。其缺点在于会杀死细胞 。

4. 细胞因子捕获

细胞因子捕获法的原理是来自不同抗体的两个重链和轻链对组合在一起，得到带有两个不同配体的两个抗原结合位点的杂交抗体。这些双特异性抗体可用于检测细胞因子。一种配体是 T 细胞特异的标记物，另一种是目标细胞因子特异的标记物。活化的 T 细胞用蛋白质转运抑制剂处理，因此细胞因子在细胞内积累。然后使用杂交抗体来捕获和检测 T 细胞表面标记的细胞因子。甲杂交抗体可用于执行此操作。杂交抗体由对目标细胞因子和常见细胞表面蛋白（如 MHC I 类）特异的抗体制成。杂交抗体结合活化的 T 细胞。如果 T 细胞分泌细胞因子，则与细胞表面结合的杂交抗体会捕获它们。然后使用针对目标细胞因子的标记二抗检测分泌细胞因子的 T 细胞。

5. 四聚体染色

T 细胞反应也可以通过其受体的特异性来测量，使用荧光标记的四聚体或特定的 MHC：肽复合物。MHC ：肽四聚体由重组 MHC 分子制成，其中特定肽与生物素-链霉亲和素结合。表达相应特异性的 T 细胞结合这些四聚体。然后对这些进行染色以进行检测，并可以通过流式细胞术进行分析！

6. 光谱分析和生物传感器检测

T细胞群的多样性可以通过光谱分析来定义。在这里，CDR3 区域通过凝胶电泳可视化，让您可以比较表达相同 V 段的受体。然后可以使用生物传感器测定来测量配体与其互补抗原受体的结合和解离率。

待测配体固定在镀金表面。然后使可溶性 T 细胞受体与结合的配体接触并结合。一段时间后，他们分离。可以使用生物传感器实时测量发生这种情况的速率。附着和脱离的速率由生物传感器监测，该生物传感器可以有效进行全内反射并 结合对玻璃芯片表面偏振光源的影响来测量镀金玻璃芯片表面分子的结合. 它检测反射光束的角度和强度的任何波动，并将其与时间绘制成图以创建“传感图” 。

也可以结合受体而不是配体。当系统饱和或达到结合和解离之间的平衡状态时，达到最大结合后，曲线将趋于稳定，表明不再发生结合。然后可以洗掉未结合的分子，在继续洗涤后，它们都开始从它们结合的蛋白质上脱落。测量相互作用的曲线将开始下降，显示发生解离的速率。

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