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使用 SYBR Green荧光染料进行荧光定量pcr检测
作者: Alpha 编辑: 苏州阿尔法生物 来源: 阿尔法生物 发布日期: 2021.12.15
信息摘要:
 SYBR Green荧光染料是 dsDNA 结合染料,可用于荧光定量pcr检测。

标签:染料 荧光分析法 荧光检测 科普 荧光定量pcr 定量pcr, pcr ,SYBR Green荧光染料

 SYBR Green荧光染料是 dsDNA 结合染料。在它与dsDNA ,结合后荧光会增加一百倍以上(图 8a)。虽然它在一定程度上与 PCR 兼容,但在较高的浓度下会 抑制 PCR 反应。在 LightCycler 仪器中,SYBR 通常 在通道 F1 中显现。SYBR 的优点是它可以与任何 dsDNA 结合;无需设计和优化探针。可以有效提高定量PCR的效率,当荧光染料 SYBR Green I 与 DNA 双螺旋结合时,在溶液中,未结合的染料显示出较小的荧光,而当它与DNA 结合后荧光就会急剧增强。

由于 SYBR Green I 染料较为稳定(在 30 次扩增循环中仅损失 6% 的活性)并且 LightCycler 仪器的滤光片组与激发和发射波长相匹配,所以它常常被用于测量总 DNA 。

 SYBR Green I 染料在PCR检测中的步骤原理:

原理如下图所示。

基因扩增

 

在扩增开始时,反应混合物含有变性的 DNA、引物和染料。未结合的染料分子发出微弱的荧光,产生最小的背景荧光信号,在计算机分析过程中将其减去。

 

 

引物退火后,一些染料分子可以与双链结合。DNA 结合导致 SYBR Green荧光染料分子在激发时发光显着增加。

 

 

在延伸过程中,越来越多的染料分子与新合成的 DNA 结合。如果连续监测反应,可以实时观察荧光的增加。在 DNA 变性进行下一个加热循环时,染料分子被释放,荧光信号下降。

 

在每个 PCR 循环的延伸步骤结束时进行荧光测量,以监测扩增 DNA 的增加量。SYBR Green I 格式与 PCR 之后进行的熔解曲线分析一起,为特定产品的鉴定和定量提供了有利的验证。

 

SYBR Green I (SG) 作为嵌入型染料广泛用于实时 PCR 应用,并以未公开的浓度包含在许多市售试剂盒中。SG 与双链DNA 的结合是非特异性的,需要额外的测试,例如 DNA 熔解曲线分析,以确认特异性扩增子的产生。熔解曲线分析的使用消除了琼脂糖凝胶电泳的必要性,因为特定扩增子的熔解温度 (Tm)类似于电泳条带的检测。当使用 SG 进行实时 PCR 多重反应时,只要 Tm 值足够,应该可以区分扩增子不同的。使用市售试剂盒和内部 SG 预混液对霍乱弧菌和嗜肺团菌进行的实时多重检测强调了性能特征的可变性,特别是仅检测到 Tm 分析评估的单一产品,但检测到琼脂糖凝胶评估的多个产品电泳。检测到的 Tm 对应于具有更高 G+C% 和更大尺寸的扩增子,表明在 PCR 期间 SG 优先结合,并导致当存在的 SG 数量有限时无法在多重反应中检测到多个扩增子。这对使用SYBR Green荧光染料 SG诊断实时 PCR 检测的设计和常规应用具有影响。

 

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