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Southern Blot实验原理及步骤详解
作者: 苏州阿尔法生物 编辑: 阿尔法生物 来源: 苏州阿尔法生物实验器材 发布日期: 2022.03.22
信息摘要:
Southern Blot步骤原理和定义:涉及将凝胶上分离的特定 DNA、RNA 或蛋白质转移到载体膜上以进行检测或鉴定的分析技术称为印迹。…

Southern Blot印迹定义:涉及将凝胶上分离的特定 DNA、RNA 或蛋白质转移到载体膜上以进行检测或鉴定的分析技术称为印迹。

变性片段从凝胶中转移到载体膜上的过程使其易于使用探针或抗体进行分析。

根据要分离的物质,印迹技术可能是——Southern印迹、Northern印迹或Western印迹,它们分别分离DNA、RNA和蛋白质。

Southern Blot是一种用于分子生物学、免疫遗传学和其他分子方法的分析技术,用于从 DNA 样品的混合物或 DNA 链中的特定碱基序列中检测或鉴定感兴趣的 DNA。

该技术由分子生物学家 EM Southern 于 1975 年开发,用于分析 DNA 限制性片段中的相关基因,因此以他的名字命名为 Southern  Blot 印迹。

Southern Blot 原理 

该过程包括将电泳分离的 DNA 片段转移到通常是NC的载体膜上,然后通过探针杂合检测目标 DNA 片段。杂合是指在单链DNA探针和单链靶DNA之间形成双链DNA分子的过程。由于探针和目标 DNA 是互补的,因此反应是特异性的,有助于检测特定的 DNA 片段。

Southern Blotting 的基本步骤

Southern Blot 

从细胞中提取和纯化 DNA

1.按照基因组 DNA 提取的标准方法从靶细胞中分离 DNA,然后进行纯化。

2.限制性消化或 DNA 片段化

3.限制性内切酶用于将高分子量 DNA 链切割成更小的片段。可以使用一种或多种限制酶来获得这样的片段。

4.电泳分离

可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,其中带负电的 DNA 片段向带正电的阳极移动,移动的距离取决于其大小。

5.脱嘌呤

部分脱嘌呤是通过使用稀释的 HCl 完成的,它通过将 DNA 片段分解成更小的片段来促进更高效率的转移。

6.变性

然后用弱碱(例如 NaOH 的碱性溶液)使 DNA 变性。这导致双链 DNA 变成单链,使其适合杂合。然后用 NaCl 中和 DNA,以防止在添加探针之前再次杂合。

7.印迹

然后将变性片段转移到pvdf或NC膜上,这是通过将凝胶放在缓冲液饱和滤纸顶部,然后将NC滤膜放在凝胶顶部来完成的。最后将一些干燥的滤纸放在膜的顶部。碎片通过毛细作用被拉向NC膜并导致凝胶的接触印迹。

8.烘烤

将NC膜从印迹叠层中取出,将附着有单链 DNA 条带的膜在真空中或在 80°C 的常规烘箱中烘烤 2-3 小时或暴露在紫外线辐射下以永久附着转移的 DNA到膜上。

9.杂合

然后将膜暴露于杂合探针,该探针是具有特定序列的单个 DNA 片段,其在目标 DNA 中的存在将被确定。探针 DNA 被标记以便可以被检测到,通常通过结合放射性或用荧光或显色染料标记分子。

10.洗涤未结合的探针

杂合后,用缓冲液彻底清洗膜以去除非特异性结合的探针或存在的任何未结合的探针。

11.放射自显影

通过将NC膜与显示杂合DNA分子的照相胶片接触,通过放射自显影检测杂合区域。在使用放射性或荧光探针的情况下,通过放射自显影在 X 射线胶片上显示杂合模式,如果使用显色检测方法,则通过在膜上显色来观察杂合模式。

Southern 应用

l 识别 DNA 样本中的特定 DNA。

l RFLP(限制性片段长度多态性)图的制备

l 检测 DNA 中的突变、缺失或基因重排

l 用于犯罪识别和 DNA 指纹识别 (VNTR)

l 转基因个体中转基因的检测与鉴定

l 限制位点的映射

l 用于传染病诊断

l 癌症的预后和遗传病的产前诊断

l 测定限制性片段的分子量并测量不同样品中的相对量。

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