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SDS-PAGE原理和实验步骤
作者: 苏州阿尔法生物 编辑: 苏州阿尔法生物官网 来源: 阿尔法生物 发布日期: 2022.04.20
信息摘要:
      SDS-PAGE 或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种根据分子量分离蛋白质的技术。是一种广泛用于法医学、遗传学、生物技术和…

      SDS-PAGE 或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种根据分子量分离蛋白质的技术。是一种广泛用于法医学、遗传学、生物技术和分子生物学的技术,根据蛋白质分子的电泳迁移率来分离蛋白质分子。

SDS-PAGE原理

SDS-PAGE 的原理表明,带电分子在置于电场中时会以相反的符号迁移到电极上。带电分子的分离取决于带电物质的相对迁移率。

由于电泳过程中的电阻较小,较小的分子迁移得更快。蛋白质的结构和电荷也影响迁移率。十二烷基硫酸钠和聚丙烯酰胺消除了蛋白质结构和电荷的影响,蛋白质根据多肽链的长度进行分离。

SDS

SDS 在 SDS-PAGE 中的作用

 SDS 是一种存在于 SDS-PAGE 样品缓冲液中的去污剂。SDS 与一些还原剂一起用于破坏蛋白质的二硫键,从而破坏蛋白质的三级结构。

SDS-PAGE 凝胶实验步骤

一、SDS-PAGE所需材料

电源: 用于将交流电流转换为直流电流。比如:天能的EPS-300,EPS-600等。

凝胶: 这些可以选择在实验室制备,也可以直接从市场上购买的Biofuraw Precast Gel预制胶。

电泳 槽:应使用适合 SDS-PAGE 凝胶的电泳槽。比如:垂直电泳槽VE180等。

蛋白质样品: 使用 SDS-PAGE 样品缓冲液稀释蛋白质并煮沸 10 分钟。还添加还原剂如二硫苏糖醇或 2-巯基乙醇以还原二硫键以防止任何三级蛋白质折叠。

运行缓冲液: 凝胶上加载的蛋白质样品在 SDS-PAGE 运行缓冲液中运行。

染色和脱色缓冲液:凝胶用考马斯染色溶液染色。然后用脱色溶液对凝胶进行脱色。然后在肉眼下可见蛋白质条带。

蛋白质阶梯: 参考蛋白质阶梯用于根据分子大小确定目标蛋白质的位置。

二、SDS-PAGE凝胶的制备流程

1.  将除 TEMED 外的所有试剂混合以制备凝胶。

2.  当凝胶准备好倒入时,添加 TEMED。

3.  将分离凝胶倒入浇注室中。

4.  在聚合之前添加丁醇以去除存在的不需要的气泡。

5.  梳子插入玻璃板之间的空间中。

6.  聚合凝胶也被称为“凝胶盒”。

     由于实验中的SDS-PAGE使用DIY自行配置凝胶,比较耗时费力,目前很多实验室会选择提前配置好的预制胶,比如采用天能的Biofuraw Precast Bis-Tris Gel 系列预制胶至少可以节约1小时左右的实验时间。

三、样品制备

(1)  在烧杯中加入纯水。

(2)  在样品缓冲液中加入 2-巯基乙醇。

(3)  将缓冲溶液放入微量离心管中,并向其中加入蛋白质样品。

(4)  将 MW 标记放在单独的管中。

(5)  将样品煮沸不到 5 分钟以使蛋白质完全变性。

四、电泳

1.  凝胶盒从浇铸台上取下并放置在电极组件中。

2.  电极组件固定在夹具架上。

3.  将 1x 电泳缓冲液倒入浇铸框架的开口中以填充凝胶孔。

4.  吸取 30ml 的变性样品在孔中。

5.  然后用盖子盖住水箱,并将设备连接到电源。

6.  将样品在 30mA 下运行约 1 小时,然后在紫外光下看到这些条带。 

SDS-PAGE的应用

  • 可用于测量分子的分子量。
  • 可用于估计蛋白质的大小。
  • 可用于比较不同结构的多肽组成。
  • 可用于估计蛋白质的纯度。
  • 可用于蛋白质印迹和蛋白质泛素化。
  • 可用于 HIV 检测以分离HIV蛋白。
  • 用于分析多肽亚基的大小和数量。
  • 用于分析翻译后修饰。
  • 用于肽图分析。

苏州阿尔法生物所提供的SDS-PAGE 、梯度预制胶、电泳仪、垂直电泳槽、水平电泳槽、核酸电泳仪、电泳仪电源等实验室设备。



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