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PCR实验方法与PCR仪的选择

作者: 阿尔法生物 编辑: 苏州阿尔法生物 来源: 苏州阿尔法 发布日期: 2022.05.13
信息摘要:
文章标签:实时荧光定量pcr仪  引物设计 生物技术 科学 科普  pcr仪 pcr 定量pcr  pcr实验室,PCR 或聚合酶链式反应是…

文章标签:实时荧光定量pcr仪  引物设计 生物技术 科学 科普  pcr仪 pcr 定量pcr  pcr实验室

      PCR 或聚合酶链式反应是分子生物学中用于创建特定 DNA 片段的多个副本的技术。这项技术是由USA生物化学家 Kary Mullis 于 1983 年开发的。通过PCR仪进行PCR 使产生数百万份 DNA 小片段成为可能。所以PCR也是分子生物学和生物技术实验室常用于见的实验室设备。

PCR的原理

PCR 技术基于 DNA 的酶促复制。 在 PCR 中,使用引物介导的酶扩增一小段DNA 。DNA 聚合酶合成与模板 DNA 互补的新 DNA 链。DNA 聚合酶只能将核苷酸添加到预先存在的 3'-OH 基团上。因此,需要一个底漆。因此,更多的核苷酸被添加到 DNA 聚合酶的 3'''末端。 

 PCR实验主要由三部分所组成:

1.DNA 模板– 样本中单链DNA。

2.DNA 聚合酶–使用 Taq 聚合酶。Taq聚合酶属于热稳定酶,在较高的温度下不会变性。

3.寡核苷酸引物s - 这些是与单链和反链的 3' 末端互补的短链单链 DNA。

4.脱氧核糖核苷酸三磷酸——它们为聚合提供能量,是 DNA 合成的基石。

5.缓冲系统——镁离子和钾离子为 DNA 变性和复性提供了良好的环境条件。它对于保真度、聚合酶活性和稳定性也很重要。


rt-PCR

PCR基本类型

PCR有以下几种类型:

1.实时荧光定量 PCR

   实时荧光定量 PCR,在荧光检测系统的帮助下实时检测 DNA 扩增。荧光报告基因的信号强度与扩增的 DNA 分子数量成正比。该实验中所使用的PCR仪器一般是荧光定量PCR仪。比如:朗基的A600 PCR

2.嵌套 PCR

通过嵌套PCR可以提高样本的敏感性和特异性。由于意外引物结合位点的扩增,减少了产物的非特异性结合。

3.多重PCR  使用多通道高通量的PCR仪可以实现同时扩增许多不同的 DNA 序列。也可以用于在单个 PCR 实验中扩增多个目标。比如朗基的T30系列PCR

4.定量 PCR

定量PCR主要用于通过 DNA 扩增线性来检测、表征和量化样品中的已知序列。

PCR基因扩增步骤

PCR PCR基因扩增主要经过3个循环反应:

变性

当反应混合物加热至 94℃ 约 0.5 至 2 分钟时发生变性。这会破坏两条 DNA 链之间的氢键并将其转化为单链 DNA。此时,单链作为产生新 DNA 链的模板。此阶段应提供较长时间的温度以确保DNA链的解离。

退火

通过PCR仪设定的程序将反应温度降至54-60℃约20-40秒。在这里,引物与模板 DNA 上的互补序列结合。引物是长度约为 20 至 30 个碱基的 DNA 或 RNA 的单链序列。

引物是 DNA 合成的起点。DNA链分开后以相反的方向运行,因此引物设计一般有两个,即:正向引物和反向引物。

延伸

在这一步,温度升高到72-80℃。Taq 聚合酶将碱基添加到引物的 3' 端。

这会在 5' 到 3' 方向上拉长 DNA。DNA聚合酶在适宜的温度下增加约1000bp/分钟。

Taq 聚合酶可以耐受较高的温度。它附着在引物上并将 DNA 碱基添加到单链中。从而获得了双链DNA分子。

这三个步骤一般重复 20-40 次,即可在短的时间内获得许多目标的 DNA 序列。

PCR技术的应用

PCR技术主要应用于以下领域:

l 药物

l 遗传病突变检测。

l 基因检测

l 检测父母的致病基因。

l 法医学

l 用作基因指纹识别的工具

l DNA鉴定

l 亲子鉴定

l 研究和遗传学

l 在基因组研究中比较两种生物的基因组

l 用于任何来源(例如化石)的 DNA 的系统分析

l 基因表达分析

l 基因图谱构建

PCR实验中常见问题及解决方案

PCR实验中常见问题汇总

问题及现象

原因

解决方案

1. PCR 后,管中的液体较少。

样品挥发,损失

确保加热的盖子达到适当的温度。

吸取样本后,尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。

移液不准确

确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到  PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。

2.在 QuickStrip 中没有足够的样本

QuikStrip 已变干。

加入 40 μL 水,在装载前轻轻上下移液以混合均匀。

3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA PCR 产物

凝胶未正确制备。

确保正确稀释电泳缓冲液。

融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前,确保溶液完全没有团块 和玻璃状颗粒,也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。

凝胶未正确染色。

染色时注意浓度,实在不行就重新染色。

电泳装置或电源出现故障。

请联系电泳仪或电泳设备供应商,帮忙排除故障

4.凝胶染色后,DNA 条带模糊。

凝胶没有染色足够长的时间。

严格按照染色流程说明进行实验操作。

5.染色后,条带可见,但不存在 PCR 产物。

PCR扩增不成功。

注意引物设计是否合理,DNA聚合酶的加入量是否适宜。

确保PCR的正确操作,温度设计是否合理。

6.染色后,凝胶上可见条带和对照 PCR 产物,其中一部分样品不存在。

PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。

熟练使用移液器进行精准移液定量,确保移液的准确度

        苏州阿尔法生物提供的PCR 试剂主要包括: ELSIA试剂盒、酶联免疫 ELSIA试剂盒、抗体、一抗、二抗、蛋白检测试剂盒、PCR引物、PCR QPCR 相关生物试剂另外还有PCR实验室相关的 PCR 、荧光定量 PCR仪、高通量PCR 仪、酶标仪等广泛应用于基因编辑、基因文库构建等分子生物学领域,更多实验室设备可咨询 0512-62956104 18934597460

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苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年,位于苏州园区生物纳米园(Biobay)A5幢301室。公司管理团队专注于科学仪器行业十三年,拥有专业的技术团队与完善的售后服务体系,目前已为300余家实验室提供优质产品和服务,涵盖各大高校、医疗机构、检测中心、科研机构、制药企业等13个群体。提供的实验室仪器主要包括振荡培养箱,PCR仪,移液器,生物反应器,发酵罐,移液器,超低温冰箱,医用冰箱,液氮罐,高压灭菌器,超纯水机,天平,离心机,离心浓缩仪,生物安全柜等。厂商企业授权包括知楚仪器、朗基、中科美菱,梅特勒,乐枫,搏旅、NEST、天根、奥盛在内的80个余厂家。

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