HEK293细胞瞬时转染技术与结果分析

HEK293细胞是新药开发研究的主要细胞，本文初步介绍了细胞的瞬时转染技术并常用的结果分析方法：

HEK293T贴壁细胞瞬时转染：

1. 使用 12.5 mL 培养基 将 HEK293T 细胞接种到 10 cm 板中，以在日培养后达到 70-80% 的融合度。

2. 为了提高转染和生产过程中的细胞粘附，用无菌聚 L-赖氨酸0.01% (w/v)，75–150 kDa，细胞培养级）制备板 15 分钟，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS；137 mM NaCl、2.6 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4、1.5 mM KH 2 PO 4）。 

3. 用 10 μg 聚乙烯酰亚胺 进行转染。将 10 μg 高质量质粒 DNA和 80 μg/mL PEI 分别稀释在 600 μL DMEM 中。

4. 将 DNA 和 PEI 溶液混合并在室温 (RT) 下孵育 15-30 分钟。DNA/PEI 复合物分布在细胞上并孵育 24 小时。

5. 第二天，培养基完全被补充有 4% (v/v) IgG 剥离 FCS (PAA) 和青霉素/链霉素的 DMEM 替代，以较大限度地减少蛋白质 A/G 亲和层析对牛 IgG 的共纯化。

6. 通常每天收获和更换培养基长达两周。每天收获和更换生产培养基长达 1-2 周。

在悬浮 HEK293-6E 细胞中瞬时转染和生产

1. 在悬浮 HEK293细胞中进行瞬时生产。简而言之，转染前两天 5×10 5细胞/mL HEK293-6E 在 25 至 150 mL 无血清培养基（不含 G418）中接种到 125 至 1000 mL 带通气膜盖的聚碳酸酯锥形瓶中，并在 37°C 和 110 rpm 下孵育在轨道振动器中。

2. 对于小规模生产，将 12 孔板中的 1 mL/孔在线性振荡器中以 150 rpm 的速度孵育。如果没有另外说明，应当在 1/10 体积的新鲜无血清培养基中制备总计 1 μg 高质量质粒 DNA 和 2.5 μg PEI/mL 培养体积。

3. 量化编码增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 或黄色荧光蛋白 (YFP) 变体 venus 的报告质粒 pEF-FS-EGFP 或 pCS2-venus 总 DNA 的 1/20 的转染效率 ，分别添加。

4. 加入 DNA/PEI 复合物后，将细胞进一步培养 48 小时。然后按照其他方法与另外体积的新鲜培养基一起添加终了浓度为 0.5% (w/v) 的胰蛋白胨 N1。

蛋白 A 纯化

所有scFv-hIgG1Fc 抗体和 scFv-hIgG1Fc-RNase 构建体可使用 1 mL Bio-Scale Mini UNOsphere SUPrA Cartridges 和Biorad的半自动 Profinia 2.0 系统，根据标准制造商的方案通过蛋白 A 亲和纯化进行纯化。

流式细胞仪分析

通常在转染后 48 小时使用流式细胞仪来测量转染效率。通过荧光 (FL) 1 中 GFP（pTTo/GFPq、NRC、BRI；总质粒 DNA 的 5%）或 YFP 的共表达来检测转染的细胞。用 2 μg/mL 碘化丙啶对死细胞进行染色。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( (SDS-PAGE)

SDS-PAGE 可以使用天能相关的试剂及电泳槽进行电泳分离。蛋白质标准品和样品在还原条件下用 Laemmli 样品缓冲液在 95°C 下制备 5 分钟，或在非还原条件下（不含还原剂的 Laemmli 样品缓冲液）在 65°C 下制备 10 分钟。使用SDS-PAGE进行凝胶电泳操作。然后进行考马斯染色。再通过 IgG/Fc 捕获 ELISA 和凝胶光密度法定量 scFv-Fc 抗体。

通过IgG/Fc捕获ELISA对生产上清液中的抗体进行定量的简要步骤如下：

1. 共 100 μL/孔山羊抗人免疫球蛋白（多价）捕获抗体（200 ng/mL）在 PBS 中稀释并包被在 96 孔微量滴定板中在 37°C 下 1 小时。

2. 在 37°C 下用 20% (v/v) FCS 封闭 1 小时后，使用洗板器用 PBST（含 0.05% [v/v] tween-20 的 PBS）洗涤孔 3 次。

3. 在含有 1% (v/v) FCS 的 PBS 中制备总共 100 μL/孔的几种样品稀释液和半稀释系列的人 IgG 蛋白标准品，并在 37 ℃孵育 1 小时。

4. 洗涤后，将总共 100 μL/孔的 20 ng/mL 山羊抗人 IgG（Fc 特异性）抗体辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联物在室温下孵育 1 小时。 37℃。并通过添加 100 μL/孔的 0.5 MH 2 SO 4停止。

5. 使用酶标仪在 450 nm 处针对 620 nm 的参考波长 (A 450 -A 620 )测量吸光度。此外，在无血清培养条件下在 HEK293-6E 细胞中产生的重组蛋白在考马斯染色后通过 SDS-PAGE 进行定量。 在还原条件下制备样品，并使用分析软件与纯化的标准蛋白质进行比较。

代谢细胞培养参数的定量测量   

用基于膜的酶分析仪对葡萄糖和 L-乳酸进行定量。同时酶标仪也可用于测量 L-谷氨酰胺与 L-谷氨酸的组合。

    HEK293-6E 中的瞬时表达与优化的表达载体和分批补料工艺相结合，可提供高达 600 mg/L 重组 IgG 样 scFv-Fc 抗体的稳健和多功能生产。  该表达系统已被证明可以在摇瓶中从毫升扩展到升体积，这可以解决高通量体外抗体生成管道的生产瓶颈。此外，与小的重组抗体片 段相比，更复杂的 IgG 样 scFv-Fc 抗体的高效分泌生产有助于下游加工并增加与标准免疫测定和其他应用的兼容性。

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