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感受态-感受态细胞-DIY
作者: Alpha 编辑: 苏州阿尔法 来源: 苏州阿尔法生物 发布日期: 2021.11.26
信息摘要:
感受态细胞是分子蛋白生物学实验中常用的一种菌株。常见的感受态有:用于蓝白斑筛选鉴别的DH5a;用于表达毒性或非毒性蛋白的BL21菌株;用于 …

感受态细胞也能diy ?

标签:感受态细胞   细胞膜 科普  离心管 

受态细胞是分子蛋白生物学实验中常用的一种菌株。常见的感受态有:用于蓝白斑筛选鉴别的DH5a;用于表达毒性或非毒性蛋白的BL21菌株;用于 DNA及质粒克隆的TOP10菌株等。但是你知道吗?其实感受态细胞也能DIY ,小编就带领大家了解一下吧,动手能力强的小伙伴也可以试试噢。

一、化学感受态细胞的制备原理

化学感受态细胞基本上是经过化学处理的细菌,使细菌能够在情况需要时,吸收外源质粒 DNA。当大肠杆菌的细胞膜被激活使质粒可以轻松 进入细胞内部,这种吸收外源DNA的状态称为能力,化学感受态细胞主要是通过热休克 进行转化。

感受态细胞

上图中我们看出:

图A中的细胞膜完整,外源DNA无法渗透;

图B中的细胞通过处理,细胞膜通透性,外源DNA可以渗透;

 

要制备具有化学感受态细胞,需要培养一批大肠杆菌并进行继代培养。然后,在大肠杆菌生长的对数增长进行收集,成为制备感受态细胞的原材料。因此,在对数生长期收集细胞至关重要。

整个实验过程中,由于是不添加抗生素的,所以我们需要注意无菌操作,谨防感染。细胞收获后,含有 15 % v/v甘油 ,浓度为 100 mM的 CaCl 2缓冲液进行处理,使膜对质粒 DNA 具有半渗透性。

完成之后,将细胞分装出来,置于在 -80 °C下冷冻即可。冷冻时注意加入定量的甘油成分,防止冻伤细胞。

二、制备前的准备:

1.在 LB 肉汤中生长的大肠杆菌菌株的新鲜过夜培养物。

2.进口的无菌离心管。

3.用于读取大肠杆菌光密度的光谱仪。

4.含有 15 % v/v 甘油的 CaCl 2,浓度为 100 mM 。。

5.可耐-80°C以下环境的离心管或冻存管。

三、感受态细胞DIY实验步骤

1.接种目的大肠杆菌菌株在 10 mL 的无菌 LB培养基中。于 37°C 下培养过夜,以 200 rpm 的速度摇晃。

2.将 1 mL 的过夜培养物重新接种到 99 mL 的无菌 LB 中,并在 37°C 下以 200 rpm 的速度摇动,直到达到 600 nm (OD 600)的光密度为 0.3 – 0.5(对数中期)。

3.将 100 mL 培养物平均分配在无菌离心管之间,并在 4 °C 下以 ~ 7000 rpm 离心 10 分钟收集细胞。丢弃上清液并使用瑞宁移液器去除残留的任何液滴。

4.将 20 mL , 100 mM的无菌 CaCl 2溶液  添加到细胞中,并轻轻地重新悬浮细胞。

5.在 4°C 下以  7000 rpm 左右的冷冻离心机离心 10 分钟左右,收集洗涤过的细胞并丢弃上清液。

6.加入 5 mL ,100 mM 的无菌CaCl 2,并辅以 15% v/v 甘油,然后轻轻地摇匀,使其重新悬浮。

7.用耐冻的离心管进行分装,每管的分装量以50 μL aliquits为宜。

8.将制备好的化学感受态细胞储存在-80°C环境中。效期约为1 年。

感受态细胞制备

实验中的注意事项:

在进行感受态制备的过程中需要注意以下几点:

由于具有化学活性的细胞失去细胞膜屏障,比较脆弱,所以在对大肠杆菌进行处理时需要轻柔对待。

由于培养物中不含抗生素,所以无菌操作很重要,尤其在进行细胞的OD 600检查时。

在为整个实验室组制备感受态细胞时,需要进行分装登记并做好标识,置于-80以下环境中保存。

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