癌细胞体外培养方法

生物反应器的低剪切应力动态培养测试完成后。

1. 选择非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系 Calu-3，并将动态培养的结果与静态悬浮培养对照进行比较。具体而言，细胞在添加了 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素/链霉素 (P/S) 和 1% 非必需品的完全培养基 (DMEM) 中生长氨基酸 (NEAA, Sigma )，并在 37°C 和 5% CO 2的水饱和气氛中维持在标准细胞培养条件下在空气中。

2. 在细胞培养瓶中扩增后，将 9x10 6 Calu-3 细胞 (1.92x10 ⁵细胞/mL) 接种在生物反应器培养室内，并在具有完全生长培养基的动态悬浮液中培养 5 天。

3. 生物反应器以 5 mL/min 的流速运行。同时，Calu-3 细胞以相同的密度接种在用作对照的低附着培养瓶（Corning Inc）上，代表静态悬浮培养模型。

4. 五天后，分别从生物反应器和低附着培养瓶中取出动态和静态悬浮培养的细胞，并重新悬浮在新鲜的生长培养基中进行进一步分析。进行三个独立的静态和动态悬浮培养。

细胞体外培养的 验证

通过倒置显微镜（Olympus ）研究从生物反应器和低附着培养瓶中收获并重新悬浮在新鲜生长培养基中的 Calu-3 细胞。

通过细胞扫描仪和图像分析软件收集和分析显微照片，以便  计算单个 Calu-3 细胞的数量和形成球体的 Calu-3 细胞的数量，以及确定球体尺寸。

细胞的TEM分析

对来自动态和静态悬浮培养物的 Calu-3 细胞进行了处理，用于透射电子显微镜 (TEM) 分析和免疫细胞化学。

 TEM 分析步骤如下：将 Calu-3 细胞固定在 Karnovsky 溶液（4% 甲醛、5% 戊二醛）中。样品在 1% 四氧化锇中后固定，并通过增加酒精浓度进行脱水。然后，用环氧丙烷洗涤样品并嵌入环氧树脂中。用亚甲蓝和番红对 0.5 μm 厚的切片进行染色，以从形态上选择感兴趣的区域。随后，在 300 目铜网格上收集超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色后，在 TEM下进行定性检查。

验证活跃细胞周期中的细胞比例

用抗 Ki67）和抗 γ 组蛋白 H2AX抗体染色细胞斑点，并用 DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显示过氧化物酶 (HRP) 底物试剂盒反应。Ki67 和 γH2AX 阳性细胞分数的定量验证是通过计算每个分析样品上计数的总共 900-2000 个细胞核中的阳性细胞核数来进行的。使用细胞凋亡试剂盒研究单细胞水平的凋亡细胞死亡。使用Olympus BX60或明美显微镜测量绿色核荧光阳性。4',6-二脒-2-苯炔醇 。通过计算总共近 1000 个细胞中的凋亡细胞核的数量来验证死细胞的比例。使用单向方差分析测试分析数据。当 p<0.05 时，结果被认为具有统计学意义。

研究在生物反应器内动态培养 

5天后细胞/球体可能意外粘附在过滤器上，过滤器用4%多聚甲醛固定，在室温下与DAPI一起孵育15分钟，依次用荧光显微镜观察验证其表面是否存在核。

验证培养室下部是否存在粘附的 Calu-3 细胞和沉淀

细胞体外培养收获时，用细胞刮刀刮擦培养室的内壁，并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤。因此将PBS收集在培养皿中并通过倒置显微镜观察以检测Calu-3细胞的存在。

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