荧光成像则需要使用外部光源激发预先引入的荧光报告基团（如荧光蛋白、特定染料或量子点）。被激发的荧光基团发射出波长更长的光并被检测。其主要优势在于能够进行多色标记，从而在同一时间点对多个不同的生物过程或细胞群体进行同步空间定位与区分，例如同时观察药物载体分布与血管新生情况。