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  • 无内毒素质粒小提中量试剂盒
天根-无内毒素质粒小提中量试剂盒-DP118
天根-无内毒素质粒小提中量试剂盒-DP118 提取的质粒DNA可适用于转染多种细胞及各种常规操作,包括酶切、 PCR、测序、连接等实验。
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DP118


天根-无内毒素质粒小提中量试剂 -DP118采用硅胶膜吸附技术,高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶 液P4和过滤柱CS,可有效的去除内毒素、蛋白等杂质;整个提取过程仅需1个小时,方便快 捷。以下操作步骤适用于提取5-15 ml过夜培养的大肠杆菌,质粒提取得率和质量与宿主菌的 种类和培养条件,细胞的裂解,质粒拷贝数,质粒的稳定性,抗生素等因素有关。 使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于转染多种细胞及各种常规操作,包括酶切、 PCR、测序、连接等实验。 提取得率 质粒类型 菌液量 得率 质粒 低拷贝 5-15 ml 5-25 µg pBR322, pACYC及其衍生载体, pSC101 及其衍生载体, SuperCos, pWE15 高拷贝 5-15 ml 15-70 µg pTZ, pUC, pBS, pGM-T 注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

储存条件

      本试剂盒在室温(15-25℃)干燥条件下,可保存12个月;更长时间的保存可置于 2-8℃。(注意:当低温贮存时,使用前应将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间,必要 时可在37℃水浴中预热10 min,以平衡溶液温度)。单独包装的RNaseA在室温可稳定保存 12个月以上。加入RNaseA后的溶液P1应置于2-8℃保存,可稳定保存6个月。

 试剂盒使用注意事项

1.溶液P1在使用前 加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNaseA全部加入),混匀,置于 2-8℃保存。

2.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明 在漂洗液PW中加入无水乙醇。 3.使用前检查平衡液BL、溶液P2和P4是否出现浑浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加 热几分钟,即可恢复澄清。

4.注意不要直接接触溶液P2和P4,使用后应立即盖紧盖子。

5.所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm (~13,400×g )。

 6.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或 大于10 kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、P4的用量,洗脱缓 冲液应在65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间,以增加提取效率。

 7.实验前使用平衡液处理吸附柱,可以充分激活硅基质膜,提高得率。

 8.用平衡液处理过的柱子 好当天使用,放置时间过长会影响效果。


TIANGEN-天根无内毒素质粒小提中量试剂盒-操作步骤

  • 1. 柱平衡步骤:向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl的平衡液BL,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请 使用当天处理过的柱子)
  • 2. 5-15 ml过夜培养的菌液加入离心管中,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min,尽量吸 除上清。 注意:菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌体量以能够充分 裂解为佳,过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。
  • 3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μl溶液P1 (请 检查是否已加入RNaseA),使用 移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
  •  注意:请务必彻底悬浮细菌沉淀,如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量 和纯度偏低。
  • 4. 向离心管中加入500 μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠, 所用时间不应超过5 min,以免质粒受到破坏。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂 解不彻底,应减少菌体量。
  • 5. 向离心管中加入500 μl溶液P4,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色 絮状沉淀,然后室温放置10 min左右,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min,此时在离 心管底部形成沉淀。 注意:P4加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再 次离心后取上清。
  • 6. 将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS(过滤柱放入收集管中),12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min,滤液收集在干净的2 ml离心管中(自备)。
  •  
  • 7. 向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染),上下颠倒 混匀后转移到吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)。 注意:过滤后滤液会损失,根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP4的  大容积为700 μl,所以需要分次过柱。
  •  8. 室温12,000 rpm (~13,400×g)离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集 管中。 注意:将第7步中所得溶液分次过柱,每次均按以上条件操作。
  •    9. 向吸附柱CP4中加入500 μl去蛋白液PD,12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,倒掉收 集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
  •   10. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW(请 检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。 注意:加入漂洗液PW后,如果室温静置2-5 min,有助于更好地去除杂质。
  •   11. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min,倒掉收集 管中的废液。
  •   12. 将吸附柱CP4重新放回收集管中,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min,目的是将吸附 柱中残余的漂洗液去除。 注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实 验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP4开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸 附材料中残余的漂洗液。
  •   13. 将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓 冲液TB,室温放置2 min,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min将质粒溶液收集到离心管 中。

注意事项:为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,重复步骤 13。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液,应保证其pH值在7.0-8.5 范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100 μl,体积过小影响 回收效率。且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。 质粒DNA浓度及纯度检测 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单 一条带,也可能为2到3条DNA条带,这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等 有关。OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA。 OD260/OD280比值应为1.7–1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值 会偏低,但并不表示纯度低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值。



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