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荧光定量PCR实验中常见问题汇总
作者: 苏州阿尔法生物 编辑: 苏州阿尔法 来源: 发布日期: 2021.07.19
信息摘要:
荧光定量PCR 是PCR实验中常见的PCR类型,下面归纳一下,客户进行PCR实验时常遇见的一些问题。希望对具有 PCR恐惧症的伙伴们能有所帮…

标签:荧光检测荧光强度 荧光定量pcr 定量pcr荧光笔

荧光定量PCR PCR实验中常见的PCR类型,下面归纳一下,客户进行PCR实验时常遇见的一些问题。希望对具有PCR恐惧症的伙伴们能有所帮助。

常见问题一: 荧光定量PCR的类型有几种?有何区别?

答:目前荧光定量PCR实验常用的方法主要有两种,即:SYBR Green I染料法和Taqman探针法,两者的主要区别在于:SYBR Green 染料的特点是只与DNA双链相结合发出荧光,而当荧光染料处在游离状态时,不会发出荧光。所以在PCR循环体系中荧光信号强度与PCR产物的数量成正比例关系。染料法荧光定量的优点是通用性比较强,几乎适用于所有的荧光定量PCR反应但也具有明显非特异性。如果PCR反应过程中出现引物二聚体或者进行非特异性扩增时,该染料也这些非特异性扩增产物结合从而激发荧光,形成假阳性信号,对PCR定量结果一定的干扰,从而影响到PCR定量结果的准确性。


SYBR Green

常见问题二:荧光定量实验中无扩增曲线是什么原因导致

答:一般来说,在荧光定量PCR实验中,无扩增曲线主要会有以下三种情况:

凝胶电泳时无条带出现,无扩增曲线。

这种情况需要考虑引物的设计是否合理?引物质量是否正常?退火温度设置是否合理?扩增体系是否正常等等。

2.第二种情况比较容易出现的是在做电泳时会正常显示条带,但没有明显的扩增曲线这种情况有可能是探针合成过程出现问题;如果探针过程正常,则需要检查探针淬火温度、程序参数设定问题确排除后则可能是仪器故障导致。

3.另外,模板被降解或模板不足时也会出现无曲线扩增现象


荧光探针

常见问题三荧光定量PCR时,有哪些需要注意的

答:在进行荧光定量PCR实验室时,需要注意以下几点:

1.PCR实验室要有独立的分区一般PCR实验室的样品处理区、PCR反应制备区、PCR扩增区,数据报告区等相互独立使用放置DNA污染

2.配置标准品的工具,包括移液器、吸头等单独使用一套工具,并且移液器的吸头是带滤芯的标准吸头。

3.尽量不要用记号笔或标签在PCR管上做标记,以免影响仪器的荧光检测4.PCR管或8排管使用完后,及时归入在指定的废弃放置区,不要与试验区域内的样本混用。

5.每个步骤都需要做好防止DNARNA污染措施。

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