我们在解冻细胞时常常会遇到问题是解冻结束后，几乎所有的细胞都死了。那么问题出在那里呢？细胞解冻时需要注意哪些问题？
其实细胞解冻时细胞死亡的主要原因有两个：一是由于细胞融化方式有问题。二是由于细胞在高速离心时被剪切。 

    针对以上原因，细胞解冻时可以尝试加入温热的培养基，让它们静置几个小时到过夜，然后洗掉含有 DMSO 的培养基，并用普通培养基加血清喂养（增加血清浓度至10% 甚至 20% 一段时间）。不过 DMSO 是有毒的，所以在显微镜下看到细胞已经沉淀后，请立即更换培养基。
如果 细胞解冻后将 DMSO 留在培养基中，那么低浓度的 dmso 对细胞的毒害程度是小的，当我们在 5-10 ml 培养基中稀释少量细胞悬液，它会进一步稀释 dmso。所以基本上可以排除在解冻初期DMSO对细胞的影响。

  实践证明，如果细胞离心时，离心机速度超过1500rpm 或离心时间过长，均会对细胞产生不同程度的伤害。所以刚解冻的细胞离心时，离心机的速度，控制在900-1000 rpm ，4-5 分钟就足够了。
另外， 保存细胞的方法也很重要。如果您将细胞直接冷冻在液氮中，这也可能导致冷休克诱导的细胞裂解或损坏细胞膜，防止这种情况的一种方法是逐渐降低温度，例如在 4 度下存放几个小时，然后转至 -20 度过夜，然后在-70度下储存几天然后转移到液氮罐中，按照这种循序渐进的方法不仅可以使细胞适应较低的温度，还可以确保它们不会发生冷致坏死导致细胞膜损伤和裂解。

细胞冻存步骤：

1.细胞冷冻前务必检查细胞活力。它们细胞活力至少92%以上。

2. 准备好冷冻介质（FBS 中的 10% DMSO）处于低温状态。

3. 将细胞以 1000 RMP 离心 5 分钟。准备标记的低温小瓶。细胞浓度应约为例如从 50 毫升烧瓶中收集的约 5000 万个细胞。您可以有 10 个小瓶，每个小瓶大约有 50 万个细胞。

4. 离心后，彻底清除培养基，轻轻敲击沉淀物使其松散。用移液管加入 5 mls 的冷冻介质重悬细胞，并将 0.5 ml 转移到每个小瓶中。盖紧盖子，将低温管放入底部有酒精的特殊低温容器中并逐渐冷却，它们通常最多可容纳 20 个小瓶。

5. 关闭顶部并将容器转移到-80冰箱。

细胞解冻步骤：
1.解 冻细胞的速度要快，取出装有一些液氮的小瓶，置于水浴锅中加温解冻。

2. 细胞解冻时，注意保持瓶子密封，放置水浴锅中的谁污染细胞，同时也要避免去污剂、细菌等进入细胞内。

3. 当冷冻细胞培养基几乎解冻一半时（大约几分钟），可向细胞中加入 0.5 份温培养基，然后立即转移到装有约 10 至 15 毫升温培养基的烧瓶中。

4. 此时DMSO被稀释，可以细胞活性检查。细胞解冻结束后即可进入下一环节的实验。

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