苏州阿尔法生物实验器材有限公司

13年专注生物实验室仪器设备&耗材综合供应

0512-6295610418934597460

阿尔法构建全服务链体系 尊享高于原厂服务的价值
Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤
作者: 苏州阿尔法 编辑: 阿尔法生物 来源: 苏州阿尔法生物实验器材有限公司 发布日期: 2022.03.04
信息摘要:
蛋白免疫印迹法是蛋白质学中常用的检测方法,Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤主要是通过SDS凝胶分离、转印到膜上并进行信号检测的方法。

蛋白免疫印迹法是蛋白质学中常用的检测方法,Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤


主要是通过SDS凝胶分离、转印到膜上并进行信号检测的方法。具体实验方法如下:

一、试剂和缓冲液

  • l 1x RIPA 缓冲液:50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脱氧胆酸钠、 1% Triton X-100 或 NP40。
  • l 1x PBS 缓冲液:137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4
  • l BCA 蛋白检测试剂盒或 Bradford 蛋白检测试剂盒
  • l 1.5 M Tris 缓冲液 (pH 8.8): 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O,使用 HCl 将 pH 调节至 8.8,最后 500 ml
  • l 1.0 M Tris 缓冲液 (pH 6.8):60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O,使用 HCl 将 pH 调节至 6.8,最后 500 ml
  • l 10% APS:使用前制备的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。
  • l 10% SDS:10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。
  • l 1x Tris-甘氨酸缓冲液:Tris配比25 mM;  PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。
  • l 3x SDS 蛋白上样缓冲液配制:使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA浓度30 mM 和 溴酚蓝 配比0.2% 。缓冲液应随用随配、分装冷冻备用。1x TTBS : 25 mM Tris(pH 7.5):0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞
  • l 1x 转移缓冲液:3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇,添加 ddH 2 O 至 1L


二、样品制备

样品也可以在一些商业裂解缓冲液中裂解,例如Thermo Fisher的 Pierce IP 裂解缓冲液 ,而不是 RIPA 缓冲液。

三、细胞培养样品制备

1. 贴壁细胞

  • l 去除上清液并用 1X PBS 洗涤以去除残留培养基。
  • l 添加预冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 缓冲液/100 mm 培养皿。在冰上孵育 5-10 分钟。
  • l 完全刮去细胞并转移到冰上预冷的 1.5 ml 微管中。
  • l (可选)彻底均质化或超声处理。
  • l 4°C 12,000 rpm 离心 10-15 分钟,收集上清液备用。
  • l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。 

2. 上清细胞

  • l (可选)取出 100 ul 等分试样进行细胞计数。
  • l 将细胞转移到预冷的 1.5 ml 微管或 15 ml 试管中,并在 4°C 下以 2000 rpm 的速度离心 5 分钟。
  • l 取出培养基,用 1 ml 预冷的 1x PBS 重悬沉淀,然后转移到 1.5 ml 微管中。
  • l 在 4°C 下以 2000 rpm 离心 5 分钟。
  • l 用 1 ml 预冷 RIPA 缓冲液/10 7 个细胞重悬细胞沉淀
  • l 将细胞悬液在冰上摇晃 30 分钟。或彻底均质化/超声处理。
  • l 4°C 12000 rpm 离心 10-15 分钟,收集上清液备用。
  • l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。

3.组织制备

  • l 组织制备和定量。把它们切成小块。
  • l 添加约 500-600 ul 预冷的 1x RIPA 缓冲液/100 mg 组织。
  • l 彻底均匀组织。
  • l 在 4°C 下以 12000 rpm 离心 15-20 分钟。
  • l 收集上清液备用。
  • l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。


分离凝胶浓度(%)

蛋白质大小范围 (kDa)

8

25-200

10

15-100

12.5

10-70

15

12-45

20

4-40

上图中:蛋白质分离范围由分辨凝胶浓度决定。Tricine-SDS-PAGE 可用于分离小于 30 kDa 的蛋白质的电泳系统 。

四、蛋白质定量


蛋白印迹实验步骤中的蛋白定量主要采用Bradford 法和 BCA 法。

1. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶制备:6%-15% 分离凝胶由顶部的浓缩凝胶 (5%) 和凝胶梳(10 或 15 个孔)制成。

溶解凝胶(10ml)

浓缩凝胶(3ml)

 

6%

8%

10%

12%

15%

 

H 2 0

5.3

4.6

4.0

3.3

2.3

2.1

30% 丙烯酰胺混合物*

2.0

2.7

3.3

4.0

5.0

0.5

1.5M Tris(pH 8.8)

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

1.0M Tris (pH 6.8) 0.38

10% SDS

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.03

10% APS

0.1

0.1

0.1

.1

0.1

0.03

TEMED

0.008

0.006

0.004

0.004

0.004

0.003

五、上样和电泳


l 将 2X SDS 蛋白质上样缓冲液与蛋白质样品以 1:1 的比例混合。样品预热到 50-60°C。进行预染。

六、蛋白质转移

将蛋白质转移到 PVDF 或 NC 膜上进行抗体检测。


  • l 在 1X 转印缓冲液中预润湿凝胶、Whatman 纸和海绵等材料。
  • l PVDF 膜应在甲醇中孵育 10 秒。至 1 分钟,然后移至 1X 转移缓冲液。
  • l 将以下材料堆叠:外壳(黑色面)、海绵、Whatman 纸、凝胶、膜、Whatman 纸、海绵、外壳(透明面)。
  • l 将黑色面朝黑色放入转印设备中。
  • l 在低温环境中,使用转印缓冲液进行转印操作。转印电流和时间可以根据实验过程和使用说明进行优化。
七、抗体孵育



  • l 一抗在 1X TBST+3% BSA 中以推荐的稀释度稀释或根据结果优化稀释度。
  • l 在 4°C 下孵育过夜或更长时间,或在室温下孵育 4 小时。
  • l 回收一抗并储存在 4°C。然后在 RT 的振动筛上洗涤膜 3X 5-10 分钟。
  • l 在 1X TBST 中稀释二抗并将膜在室温下孵育 1 小时或在振荡器上在 4°C 下孵育 2-4 小时。
  • l 在 RT 的摇床上用 TBST 洗涤 3X 10 分钟。

ECL+ 系统和 X 射线胶片用于 HRP 标记的二抗。


苏州阿尔法生物实验器材有限公司13年专注于生物实验室仪器与试剂耗材的供应,试剂耗材包括BCA检测试剂盒、PVDF膜、半干转系统、缓冲液、SDS凝胶、上样缓冲液、裂解液等上千个品种,更多 蛋白印迹实验步骤相关资讯0512-62956104进行咨询。

 

更多产品内容请咨询:0512-62956104  或  18934597460


苏州阿尔法生物实验器材有限公司成立于2008年,位于苏州园区生物纳米园(Biobay)A5幢301室。公司管理团队专注于科学仪器行业十三年,拥有专业的技术团队与完善的售后服务体系,目前已为300余家实验室提供优质产品和服务,涵盖各大高校、医疗机构、检测中心、科研机构、制药企业等13个群体。提供的实验室仪器主要包括振荡培养箱,PCR仪,移液器,生物反应器,发酵罐,移液器,超低温冰箱,医用冰箱,液氮罐,高压灭菌器,超纯水机,天平,离心机,离心浓缩仪,生物安全柜等。厂商企业授权包括知楚仪器、朗基、中科美菱,梅特勒,乐枫,搏旅、NEST、天根、奥盛在内的80个余厂家。

  在提供产品的同时也为您提供生物实验室常用的耗材试剂,以及实验室整体搬迁、第三方检测、计量与校准,二手仪器调剂等服务。完整的实验室一站式体验使您的选择更加方便、快捷、灵活。 

  阿尔法性价比:一级代理;一手货源;进口品质,国产价格; 

  阿尔法交货期:自有仓库,标准品有库存,常规试剂耗材备有现货;  

 阿尔法服务项目:实验室现场规划,提供选型建议,合理化配置; 

  阿尔法售后服务:及时响应,2小时给出解决方案,12小时内响应服务。

  阿尔法增值服务:免费供样机体验,免费提供样品试用,免费安装指导,免费技术指导  

  阿尔法质保期:终身质保,免费更换配件

四张拼图

阿尔法推荐资讯

我们正青春

我们正青春

时值青春我们有什么资格不努力?风华正茂我们有什么理由不奋起?!
2021-09-30
瑞宁移液器吸头促销—开学季大礼包

瑞宁移液器吸头促销—开学季大礼包

瑞宁移液器开学季促销:买三送一,买十送一。
2021-08-31
细胞培养

细胞培养前景怎么样-细胞培养的机遇与挑战有哪些?

在制药行业,细胞培养已成为抗体生产的重要组成部分。细胞培养技术已被用于生产轮状病毒、脊髓灰质炎、天花、肝炎、风疹和水痘等相关抗体。基于细胞的流感抗体也已获准在美国和许多欧洲国家使用。那么细胞培养前景怎么样?
2022-03-08

咨询热线

0512-62956104