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天根试剂盒-mRNA提取操作步骤
作者: 苏州阿尔法生物 编辑: 苏州阿尔法 来源: 阿尔法生物 发布日期: 2022.11.09
信息摘要:
天根试剂盒-mRNA提取操作步骤, 建立石蜡/新鲜组织总RNA提取操作规程。范围:适用天根石蜡/新鲜组织总RNA提取的操作

建立石蜡/新鲜组织总RNA提取操作规程。

范围:

适用石蜡/新鲜组织总RNA提取的操作。

职责:

研发实验室负责人负责维护本制度的适用性和执行有效性,并对RNA提取的质量进行监督。

内容:

实验前试剂材料准备与检查工作如下:

  1. 图1:天根提取试剂盒

  2. RNA提取试剂盒(天根;常温放置)
  3. 裂解液RL
  4. RNase-Free DNase I干粉(天根;保存
    在2-8℃)

无水乙醇;

  1. β-巯基乙醇
  2. RNase-free高压灭菌的1.5ml EP管;
  3. RNase-free高压灭菌的各类移液枪头;
  4. RNase-free水。

操作步骤

第一部分:组织前处理:

  1. 石蜡组织前处理:
  2. 取1ml二甲苯置于1.5ml EP管中,用管中二甲苯冲淋玻片,在湿润时用刀片刮取石蜡组织至EP管中,共刮取4至8片石蜡玻片(或切取2-8片5-15 µm厚的石蜡切片),不超过8片;


图2:石蜡玻片组织样本处理


图3:石蜡包埋组织样本处理

  1. 震荡混匀器上强力振荡20s,18000rpm室温离心3min,用微量移液器去除上清,小心不要移走沉淀的组织块(可以适情况重复上面步骤一次);
  2. 加1ml无水乙醇至EP管,震荡混匀后,18000rpm室温离心3min,移除上清,小心不要移走沉淀的组织块;
  3. 打开管盖,37℃挥发5-10min(或至酒精均已挥发无酒精味);
  4. 新鲜组织前处理:

采用一次性的剪刀或刀片将新鲜组织块(10-20mg)在含有300μl裂解液RL(使用前检查是否加入1%的β-巯基乙醇)的灭菌1.5mLEP管中分割成小组织块(尽量减碎)。

第二部分:组织消化:

  1. 石蜡组织消化:加入200ul裂解液RF 以及10ul蛋白酶K 于沉淀中,彻底涡旋混匀;55℃孵育30~60 min 之后80℃孵育15 min。
  2. 新鲜组织消化:加入590ulRNase-Free ddH2O和10ul蛋白酶K于沉淀中,混匀后56℃处理60min。

图4:组织消化

第三部分:RNA吸附

  1. 室温(20-25℃),12,000 rpm(~13,400×g)离心5 min,转移上清入新的RNase-free离心管中;


图5:转移上清

  1. 石蜡样本:加入220ul的缓冲液RB,涡旋混匀,加入660ul的无水乙醇;新鲜组织:缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇。


图6:加入0.5倍上清体积无水乙醇

  1. 混匀(此时可能出现沉淀),转移700μl溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中),12,000 rpm(~13,400×g)离心30~60 sec,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中;


图7:混合液转移

  1. 重复上一步骤,直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3,弃废液,将吸附柱CR3放回收集管中。

第四部分:DNase消化:

  1. 向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1,12,000 rpm(13,400×g)离心30-60s,弃废液,将吸附柱放回收集管中。(对于新鲜组织,此步骤可以省去);


图8:去蛋白液洗涤

  1. DNase I储存液的配制:将DNase I干粉溶解在500ul RNase-free水中,轻柔混匀,分装(50ul/管)后-20℃储存(可保存9个月),每次按照实验要求取出。请注意将融化的DNase I的储存液置于4℃储存(可保周),请勿再次冻存;


加水
揭盖
轻柔混匀

分装
-20℃储存(可保存9个月)
图9:DNase储存液配制

  1. DNase I工作液的配制:取50ulDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中,加入350 ulRDD溶液,轻柔混匀;


图10:DNase工作液配置

  1. 向吸附柱CR3 中央加入80ul的DNase I 工作液,室温放置15min;

图11:DNase室温消化15min

第五部分:RNA洗脱

  1. 向吸附柱CR3 中加入500ul去蛋白液RW1,室温(20~25℃),12,000rpm(~13,400×g) 离心30-60s,弃废液,将吸附柱放回收集管中;
  2. 向吸附柱CR3 中加入500ul漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇), 室温静置2min,12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60s,弃废液,将吸附柱CR3放回收集管中;


图12:漂洗液RW洗涤

  1. 重复上述步骤;
  2. 室温(20~25℃),12,000 rpm(~13,400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  3. 将吸附柱CR3 转入一个新的RNase-free 离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100ulRNase-free ddH2O,室温放置2min,12,000 rpm(~13,400×g)离心2min,得到RNA 溶液。
  4. 在管壁和管盖上标清样本唯一性编号;
  5. 将RNA用于后续操作或冻存在-80℃;
  6. 及时做好纸质和电子文档记录。

第六部分 RNA质量检测

  1. 完整性:琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。由于固定和包埋的条件限制,FFPE样本核酸通常发生片段化并且会被甲醛化学修饰,因此较难提取,本试剂盒提取的RNA可应用于RT-PCR等下游试验。


图13:漂洗液RW洗涤
该试剂盒能可从新鲜组织中快速提取总RNA,可同时处理大量不同样品。提取的总RNA纯度极高,没有蛋白质和其他杂质污染。例如利用该试剂盒分离大鼠不同组织总RNA, 琼脂糖凝胶电泳结果显示,在7~15kb处,高分子RNA(mRNA和 hnRNA)呈不连续的带状分布,在5kb(28S)和2kb(18S)有两条主要条带。

  1.      纯度分析:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA,OD260/OD280 读数在1.8-2.1 之间,比值为2.0 是高质量RNA 的标志。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品,假定在10mM Tris,pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间,但这并不表示RNA 不纯。

  2. 苏州阿尔法生物提供的天根试剂盒包括DNA提取试剂盒,RNA提取试剂盒,质粒小提试剂盒,胶回收试剂盒,ELsias试剂盒等。所有产品均低于天根官网的目录价,详细了解拨打0512-6295610418934597460.

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