通过激活和干扰筛选解码人类原代T细胞的刺激反应

在自身免疫、免疫缺陷和癌症中，受刺激的 T 细胞中细胞因子产生的调节可能会被破坏。刺激依赖性细胞因子调节剂的系统发现需要功能丧失和功能获得研究，这在人类原代细胞中一直具有挑战性。通过报告人类原代 T 细胞中的全基因组 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和干扰 (CRISPRi) 筛选，以识别控制白介素-2 (IL-2) 和干扰素-γ (IFN-γ) 产生的基因网络。

CRISPR 激活与干扰筛选技术概述

《科学》杂志中关于CRISPR 激活、筛选有新进展，CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选是测试基因功能得失的强大工具，但它们的使用在很大程度上仅限于永生化细胞系。Smite等人报告了一种优化方法，使他们能够对人类原代 T 细胞进行全基因组 CRISPRa 和 CRISPRi 筛选。然后，这种方法被用来检查调节关键治疗相关细胞因子产生的基因。然后将合并的 CRISPRa 扰动与单细胞 RNA 测序 (CRISPRa Perturb-seq) 相结合，使他们能够探究细胞因子产生的调节剂如何控制 T 细胞活化并编程为不同的活化后状态.

人类 T 细胞对抗原刺激的反应，包括细胞因子的产生，对健康的免疫功能至关重要，并且可能在自身免疫、免疫缺陷和癌症中失调。系统地了解调节 T 细胞激活与功能获得和功能丧失基因扰动的调节剂将提供对疾病途径的更多见解，并为设计下一代免疫疗法提供更多机会。

CRISPR 激活与干扰筛选的基本原理

尽管 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选是在永生化细胞系中进行功能获得和功能丧失研究的强大工具，但在原代细胞类型中大规模部署它们一直具有挑战性。在这里，研究团队在原代人类 T 细胞中开发了一个 CRISPRa 和 CRISPRi 发现平台，并对响应刺激的细胞因子产生的功能调节剂进行了全基因组筛选。由于 T 细胞中内源白介素-2 (IL-2) 产生或 CD8 中干扰素-γ (IFN-γ) 产生的水平，通过荧光激活细胞分选到高和低箱中分离 CRISPRa 扰动细胞池+ T 细胞。命中包括近端 T 细胞受体 (TCR) 信号通路基因，表明这些成分的过表达可以克服信号“瓶颈”并调节刺激和细胞因子的产生。

使用 CRISPRi 的互惠全基因组功能丧失筛选检测到具有关键调节功能的命中，包括 CRISPRa 遗漏的一些命中。相比之下，CRISPRa 还发现了可能不需要的命中，在某些情况下，在筛选条件下仅以低水平表达。核因子 κ B (NF-κB) 信号通路对 IFN-γ 产生的调节有力地证明了这一点，其中 CRISPRi 确定了所需的 TCR-NF-κB 信号通路（包括MALT1和BCL10）。CRISPRa 选择性地检测到一组也通过 NF-kB 发出信号的肿瘤坏死因子超家族受体，包括 4-1BB、CD27、CD40 和 OX40。在他们的实验条件下，这些受体并不是单独信号传导所必需的，但在过度表达时可以促进 IFN-γ。因此，CRISPRa 和 CRISPRi 在功能性细胞因子调节剂的全面发现方面相互补充。阵列 CRISPRa 扰动验证了关键命中对 CD4 +和 CD8 + T 细胞的影响。他们还通过测量一组分泌的细胞因子和趋化因子，评估了单个 CRISPRa 扰动如何更广泛地重新编程 IL-2 和 IFN-γ 之外的细胞因子产生。

新平台的开发与支持

Smite团队还开发了一个平台，用于在原代人类 T 细胞中结合单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 读数 (CRISPRa Perturb-seq) 进行合并 CRISPRa 扰动。他们使用 CRISPRa Perturb-seq 对由 70 个全基因组筛选命中和对照引起的单细胞状态进行深度分子表征，以揭示细胞因子产生的调节剂如何调节 T 细胞活化并将细胞编程为不同的刺激响应状态。

他们的研究证明了一个强大的平台，用于在原代人类 T 细胞中大规模汇集 CRISPRa 和 CRISPRi。成对的 CRISPRa 和 CRISPRi 筛选能够对可以调节细胞因子产生的基因网络进行全面的功能定位。通过阵列表型分析和汇集的 scRNA-seq 方法对 CRISPRa 命中进行跟踪，可以对关键筛选命中进行精确的功能表征，揭示关键扰动如何将 T 细胞调整到治疗相关状态。未来在原代细胞中进行的 CRISPRa 和 CRISPRi 筛选可以确定改进的下一代细胞疗法的目标。

研究学家Arrayed CRISPRa 确认了关键命中并启用了多重分泌组表征，揭示了重塑的细胞因子反应。将 CRISPRa 筛选与单细胞 RNA 测序相结合，可以对筛选命中进行深度分子表征，揭示了扰动如何调节 T 细胞活化并促进以不同细胞因子表达谱为特征的细胞状态。这些筛选揭示了重新编程关键免疫细胞功能的基因，这也为免疫疗法的设计提供参考。

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