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RNA提取和DNA提取实验中常见问题
作者: 苏州阿尔法生物 编辑: 阿尔法生物 来源: alpha 发布日期: 2021.11.25
信息摘要:
RNA提取和DNA提取实验在分子生物学中比较常用,但有时会出现产量低、纯度低、易降解等情况。

RNA提取和DNA提取 实验在分子生物学中比较常用,但有时会出现产量低、纯度低、易降解等情况,下面就实验中常见问题及实验过程中的注意事项做以汇总:

一、RNA提取和DNA提取实验中常见问题

1.产量

如果您遇到的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期,则需要考虑许多因素。通常,这是一个裂解问题。不完全裂解是产量低的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优质乙醇(100% 200 标准)稀释缓冲液或添加到结合的步骤。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水分,并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不正确,您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA 。

2.低纯度

如果提取的 DNA 被蛋白质污染(低 260/280),那么您可能开始时样品过多,而蛋白质没有完全去除或溶解。

如果 DNA 的 260/230 比率不佳,则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液,如果问题仍然存在,请再次洗涤色谱柱。

与其他样品相比,一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题,因为腐殖质在提取过程中会被溶解。

腐殖质的行为与 DNA 相似,很难从硅胶柱中去除。

3.降解

降解问题是RNA制备中常常到的问题。因为在 RNA 提取过程中,样品储存不当或裂解效率低等情况都会导致降解。 对于 DNA 提取,降解不是一个大问题,因为对于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常,如果 不希望有较多剪切的 DNA,可以使用弱裂解的方法。

DNA提取

二、PCR 清理时的注意事项

PCR 净化其实并不是 DNA 提取技术本身,但它是一种效率高且简单的技术,它只是添加高浓度的结合盐(通常每体积 PCR 反应 3-5 体积盐)和离心来过滤。

在实验过程中,PCR Clean-up 试剂盒出现故障也会导致整个实验功亏一篑。

因为在PCR 反应中有较多吸收 260 度紫外线的物质,比如:核苷酸、去污剂、盐和引物。所以,PCR 净化试剂盒经常无法正常工作可能是由于 PCR 反应失败所造一般成较难清理。

RNA提取

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