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PCR扩增仪的原理及扩增实验中存在的问题
作者: 苏州阿尔法生物 编辑: 苏州阿尔法 来源: 发布日期: 2021.08.05
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PCR检测方法有很多,其中PCR扩增仪又称为“PCR仪”,它是PCR实验中不可缺少的实验室设备之一。PCR仪器大致可以分为三类:即:普通PCR仪,荧光定量PCR梯度PCR原位PCR仪等 

一、PCR的原理 

在pcr扩增实验中,PCR反应过程实质就是DNA按模板复制而发生的聚合酶链反应的过程,主要包括引物、dNTP、DNA靶序列、DNA聚合及PH缓冲液体系。

PCR扩增

  

PCR反应过程如下

1.通过升温反应体系混合物一般为:94/15s-30s.使目标DNA双螺旋的氢键产生断裂从而形成单链DNA作为合成模板.

2反应体系冷却至引物的TM值左右,使引物与单链DNA模板产生互补结合从而实现DNA的互补扩增,这一过程也被称之为退火。

3扩增延伸

PCR扩增过程中,当反应体系的温度高到72 ℃左右时,引物在TAQ聚合酶的作用下,以引物为起点dNTP作为底物合成新的DNA

 以上步骤重复循环,直扩增量达到基因检测的所需要数量即可停止循环。

使用PCR扩增仪进行PCR反应过程中常见的问题:

无明显的扩增条带

这种情况主要是由于以下情况产生: 

1Taq酶失活或Taq酶活性加入量少所造成DNA聚合Taq酶的保存温度一般在-20℃环境下,尽量避免反复冻融所产生的影响。

2混合模板反应体系中如果含有甲酸、甲醛等杂质也会对DNA链上的碱基造成影响,降低PCR扩增效果。

3PCR仪的各反应阶段适宜温度设定也很重要,过高或低的反应温度,都会使DNA聚合酶产生失活。

4引物设置不合理或反应系统中蛋白酶及核酸酶,这些因素也同样会影响到DNA的合成与产出。

 5另外,PCR循环数不足或者延伸扩增时间短也会影响到PCR产物产量。

PCR扩增

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