随着生物反应器的普遍使用及发展，使用生物反应器生产细胞和再生组织，已成为生物医学工程研究的主流。CM领域作为新兴研究领域开始实践将工程组织将转化为可行的食品。利用生物反应器生产人造肉的流程是什么样的？将会面临哪些需要解决的问题呢？

一、组织工程人造肉生产与养殖肉类的区别

养殖肉类和生物医学组织工程之间的主要差异主要表现在：成本、规模、口感、可接受程度等。其中组织工程中影响较大的对生物支架的材料的选择方面。 制造 CM 的一个关键考虑因素是制造方法。在自上而下的方法中，预制支架上装有细胞，然后灌注以允许细胞迁移和 ECM 形成。在自下而上的方法中，较小的模块化单元（例如载有细胞的片材、管、球体、类器官或其他微结构）可以用作组装的构建块。结合这些方法也可用于制造复杂的肉制品。制造方法的选择将取决于各种参数，例如产品的类型、产品的结构、产品的质地以及该方法对商业放大的适用程度。虽然已经在实验室规模构想了许多制造方法，但尚不清楚其中哪些可能最好地转化为工业。一些对生物医学应用有效的方法可能对 CM 不切实际，而其他在生物医学领域证明不足的方法可能值得重新考虑用于食品生产。

二、利用生物反应器生产人造肉的流程是什么样的？

     CM的生产过程大致可分为四个主要领域。起初，需要从感兴趣的物种中培养出能够分化为肌肉纤维、脂肪细胞和少数其他重要细胞类型（如成纤维细胞）的细胞系。 其次，需要开发使用低成本、食品安全成分支持高增殖率的培养基配方。再者，至少对于某些生物过程和产品类型，需要开发模拟 ECM 功能的食品安全支架。而后，必须开发和扩展生物反应器和生物工艺，同时牢记与成本、无菌、食品安全以及维持长期细胞生长和组织的适当条件的能力相关的限制成熟。   虽然生物制药行业在高达 20 000 L 的搅拌罐生物反应器中培养哺乳动物细胞，但仍然需要生物反应器设计方面的重大创新，特别是在支持大规模生产结构化组织的能力方面。根据所需的最终产品和选择的生产工艺，可能需要增加收获后加工步骤来将细胞或组织形成最终产品。这些过程可能因产品而异，在许多情况下可能类似于用于加工传统肉类的方法。

    在实践中，不同公司和产品的生产过程细节可能会有很大差异，任何生产过程的初始阶段都是从感兴趣的物种中分离和表征合适的细胞，并将这些细胞储存起来以备将来使用。在许多情况下，这一步将包括开发稳定的永化细胞系。公司可以自己进行细胞分离和细胞系开发步骤或许可使用现有的细胞系。在第2个阶段，细胞扩增以增加总生物量。目标是产生大量细胞倍增，同时保持细胞处于未分化状态，因此处于增殖状态。这一过程中，细胞在搅拌罐生物反应器中生长，并且可以在微载体上、作为聚集体或作为单个细胞生长。

     在第3阶段——组织成熟——细胞在促进细胞分化和成熟的条件下生长，通常但不总是在支架上。培养基和生物反应器的选择在 II 期和 III 期都至关重要，并且在两个阶段之间可能会有所不同。对于某些产品类型，将工程组织转化为最终产品需要最后的加工步骤。例如，载有成熟肌纤维的支架可能与可食用的微载体结合，脂肪细胞在单独的 III 期过程中已在其上分化形成汉堡肉饼。或者，可以在相同的支架上区分多种细胞类型，然后将其组合形成最终产品，或者可以堆叠无支架片（其中分泌的 ECM 蛋白代替支架）。 

三、用于细胞培养和组织工程的生物支架形式及挑战

   组织工程所使用的生物支架形式主要有以下几种。即：微载体、多孔支架、水凝胶或纤维支架。

    生物支架中较简单的是微载体，通常用于大规模细胞增殖。对于组织成熟，大多数支架可分为多孔支架、水凝胶或纤维支架。虽然多孔支架和纤维支架都包含介质可以循环通过的空隙空间，但它们的结构不同，多孔支架具有海绵状结构，而纤维支架由长而细的纤维组成。通常，纤维支架是通过静电纺丝生产的，但适用于组织工程的高度相似的结构也由某些真菌生产。在某些情况下，微载体也属于其他三类之一，常见的是水凝胶。微载体一般用于生物反应器中细胞的悬浮培养。3D 生物打印等添加剂方法也很常见，并且经常使用基于水凝胶的生物墨水。

1. 微载体

    微载体自1967 年出现后，主要用于扩大制药和生命科学研究行业的细胞规模。这些细胞类型包括人间充质干细胞 (MSC)、胚胎干细胞 (ESC)、和诱导多能干细胞 (iPSC)。微载体主要由聚苯乙烯、交联葡聚糖、纤维素、明胶或聚半乳糖醛酸 (PGA) 组成，并涂有胶原蛋白、含有粘附基序的肽或正电荷以促进细胞粘附。它们的直径通常在 100 到 200 µm 之间。

  原代牛成肌细胞已经实现在微载体上培养，并能够进行珠对珠的转移。然而，依赖于从载体中去除酶对于扩大规模来说可能成本过高，因为与制药行业相比，食品行业的利润率要小得多。使用微载体进行CM还要考虑的因素是优化载体的形状，以保护细胞免受流体的剪切应力或充气生物反应器中的气泡破裂。

    所以微载体技术虽然可以以较小的空间来大规模扩增哺乳动物细胞，但它们也可能在引入与细胞解离和分离成本、微载体本身的成本、细胞密度相关的问题索限制。从而对产品的营养和或感官特性的潜在影响。

2. 多孔支架

    孔径在几十到几百微米范围内的支架具有海绵状结构，可为种子细胞形成组织和沉积 ECM 提供所需的机械稳定性。对于肌肉组织工程，这些支架应概括肌周结缔组织的结构、机械性能和组成，考虑到支架仍将是成熟组织的一个组成部分。

常用的支架制造技术，如颗粒浸出、熔体成型、冷冻干燥和气体发泡等经常使用合成聚合物，应将其替换为可食用的用于 CM。另外，通过快速冷冻明胶和透明质酸溶液产生多孔支架之间的孔隙率 >90%，虽然能够支持猪脂肪干细胞的附着、增殖和分化，但对 CM 的适用性可能受到成本和规模考虑的限制。所以孔径、孔隙率和支架材料是影响组织发育和细胞存活的关键因素。同时，还应考虑整合适合培养基灌注的较大孔，以允许在较厚的 CM 块中有效运输营养物质和氧气。

3.纤维支架

随着静电纺丝和旋转喷射纺丝技术的出现，特性的纳米纤维可称为CM生物支架的选择。比如通过旋转喷射纺明胶丝的技术，使显微孔隙率保持在 20% ~60% 之间，这样有足够的纤维间空间以促进氧气、养分和废物的运输。这种纺丝技术可应用于多种材料，包括聚乳酸 PLA， PLGA ，PCL、藻酸盐、醋酸纤维素、GelMA,纤连蛋白, 白蛋白,明胶等。

4.水凝胶

    水凝胶是一种具有大持水能力的亲水性聚合物基质，其中基质通过物理或化学方式交联。大多数与 CM 相关的细胞类型位于 ECM 内部，ECM 本身就是一种水凝胶。因此，水凝胶是 CM 组织工程的合理生物材料选择。水凝胶对组织工程有几个重要的要求。聚合物基质应该是细胞相容的，由对细胞无毒的生物材料制成。因为微量营养素和信号分子必须能够到达整个组织的细胞，水凝胶的扩散动力学应该允许这些分子以支持细胞所需的浓度和速率穿透水凝胶的整个厚度。扩散动力学取决于水凝胶的交联和微孔结构。水凝胶的硬度可以影响细胞运动、增殖和分化。太硬的水凝胶会抑制增殖和迁移，细胞需要能够在组织成熟期间重塑水凝胶。水凝胶的生物化学对细胞相容性至关重要。细胞粘附和蛋白水解位点应结合到水凝胶中，以促进细胞粘附和迁移。

5.另一种可能适用于 CM 的策略是 3D 生物打印，它允许使用具有所需流变特性的生物墨水以定义的模式沉积细胞。对于 CM 应用，生物墨水必须是可食用的或能够在培养期间完全生物降解成可食用成分。尽管 3D 打印已被证明可用于多种材料，但大多数与 CM 相关的生物墨水都是基于水凝胶的。

6.无支架培养法

通过堆叠或其他方法组合多个平面细胞片也可用于形成 3D 组织。在这种情况下，根本不使用支架或生物墨水材料，细胞由它们自己分泌的 ECM 保持在一起。

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