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DNA提取试剂盒的工作原理
作者: 苏州阿尔法 编辑: alpha 来源: 苏州阿尔法生物实验器材有限公司 发布日期: 2021.11.25
信息摘要:
不了解 DNA提取试剂盒的工作原理?我们在本文中介绍了基础知识使你可以完善您的核酸分离并获得高质量的 DNA。

文章标签: 缓冲液 dna提取 蛋白质 乙醇 色谱柱 试剂

不了解 DNA提取试剂盒的工作原理?我们在本文中介绍了基础知识,因此您可以完善您的核酸分离并获得高质量的 DNA。

DNA提取是分子生物学实验中必不可少的基础实验步骤。因为我们在分子生物学中所做的几乎所有事情在开始都需要 DNA 或 RNA,无论是 qPCR、分子克隆、下一代测序还是其他任何东西。 

如今,大多数实验室都使用商业 DNA 提取试剂盒,这些试剂盒使用硅胶自旋过滤法来获得高质量的 DNA。这些可以快速有效地纯化 DNA(或 RNA)。但这确实意味着很多人只是按照说明操作,并不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理。

RNA提取

为什么要了解核酸提取试剂盒的工作原理? 

离心柱包含一种硅胶树脂,可根据盐条件和受提取方法影响的其他因素选择性地结合 DNA 和 RNA。这些 DNA 提取试剂盒使整个过程比旧的 DNA 分离方法更容易、更快。但是,使用套件的缺点是,如果您不了解套件的黑匣子中的内容,则会使故障排除变得更加困难。

因此,在本文中,我将详细解释 DNA 提取试剂盒的工作原理以及每一步的操作。

我还将讨论在 DNA 提取中使用硅胶柱的一些常见问题,只要稍微了解一下就可以克服或避免这些问题。

一、 RNADNA提取:

裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异,但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

Chaotropes(离液剂)的作用:Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

洗涤剂:除了离液剂外,裂解缓冲液中通常还有一些去污剂,以帮助蛋白质溶解和裂解。

溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型,也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,实际上在这些变性缓冲液中效果较 好;当蛋白质变性增多,蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而,溶菌酶在变性中不起作用,因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之前进行。

二、关于质粒制备的注意事项

分离质粒 DNA 与提取 RNA 或 基因组 DNA 的提取方式是不相同的,因为必须质粒与基因组 DNA 必须分离。如果此刻, 您加入离液剂将立即释放所有物质,并且无法将小环状 DNA 与高分子量染色体区别开来。因此,在质粒制备过程中中,直到裂解后才加入离液剂,盐用于结合。

三、DNA 提取后纯化:将 DNA 与色谱柱结合

离液盐对于裂解至关重要,而且对于将 DNA(或 RNA)与色谱柱结合也是如此。此外,为了增强和影响核酸与二氧化硅的结合,还添加了酒精。

大多数情况下这是乙醇,但有时可能是异丙醇。乙醇百分比和体积有很大的影响。太多,你会带入大量降解的核酸和小物种,这会影响 A260 读数并降低你的一些产量。太少,可能难以从膜上洗掉所有盐分。

如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污剂,请尝试使用NaCl 作为沉淀剂, 以避免去污剂污染 DNA 或 RNA。

RNA

四、洗涤 DNA(或 RNA

当裂解物通过硅胶膜进行离心分离,现在所提取的 DNA 或 RNA 应该与柱子结合,杂质、细胞蛋白和多糖应该已经通过了。  

但是,膜仍然被残留的细胞蛋白质和盐弄脏。如果样品来自植物,仍然会有多糖,也许一些色素留在膜上,或者如果样品是血液,膜可能会被染成棕色或黄色。

洗涤步骤用于去除这些杂质。

通常有两次洗涤,尽管这可能因样品类型而异。第一次洗涤通常会含有少量的离液盐,以去除蛋白质和有色污染物。这之后总是用乙醇洗涤以除去盐。

如果开始的准备工作没有大量蛋白质,例如质粒准备或 PCR 清理,则只需要乙醇洗涤。去除离液盐对于获得高产量和高纯度的 DNA 或 RNA 至关重要。一些试剂盒甚至会用乙醇清洗柱子两次。如果残留盐分,核酸的洗脱会很差,A230读数会很高,导致260/230的比率很低。对于无乙醇 DNA 和 RNA,需要进行干法离心,乙醇洗涤后,大多数方案都有一个离心步骤来干燥柱子。这是为了去除乙醇,对于清洁的洗脱液是必不可少的。  当将 10 mM Tris 缓冲液或水应用于膜进行洗脱时,核酸会水合并从膜中释放出来。如果色谱柱上仍有乙醇,则核酸无法完全再水合。如果跳过干燥步骤会导致乙醇污染和低产量。很可能在 Nanodrop 上看不到 乙醇吸光度,所以它不会出现在您的读数中。

五、RNA DNA 提取洗脱

DNA 提取方案的还剩余的步骤就是从硅胶中释放纯 DNA 或 RNA。

对于使用DNA提取试剂盒进行DNA制备,通常使用 pH 值为 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱碱性 pH 值下更稳定,在缓冲液中溶解得更快。即使对于 DNA 颗粒也是如此。水的 pH 值往往较低,低至 4-5,并且高分子量 DNA 在用于洗脱的短时间内可能无法完全再水合。

通过在离心前让缓冲液在膜中停留几分钟,可以较大限度地洗脱 DNA。

由于RNA 易溶于水,且RNA 利于处在微酸性的 pH 值环境下。

苏州阿尔法生物实验器材实验有限公司13年专注于生物实验室仪器设备和实验室试剂、实验室耗材供应,所经营的天根试剂盒包括DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、血液基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、植物组织DNA提取试剂盒等200多种类型规格,可以拨打0512-62956104或18934597460进行咨询。 

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